SIRT2在漿液性卵巢癌細胞系中的表達及其對增殖、遷移和侵襲的影響*

杜燕華，張海燕，孫　紅△(復旦大學附屬婦產科醫院，上海市女性生殖內分泌相關疾病重點實驗室，上海000)

SIRT2在漿液性卵巢癌細胞系中的表達及其對增殖、遷移和侵襲的影響*

杜燕華1，2，張海燕1，孫紅1△
(1復旦大學附屬婦產科醫院，2上海市女性生殖內分泌相關疾病重點實驗室，上海200011)

［摘要］目的:研究SIRT2在卵巢表層上皮( ovarian surface epithelium，OSE)及漿液性卵巢癌( serous ovarian carcinoma，SOC)細胞系中的表達情況并從細胞增殖、遷移和侵襲這3個方面探討SIRT2對SOC惡性生物學行為的影響。方法:運用Western blot技術檢測OSE和SOC細胞系中SIRT2蛋白的表達水平;設計靶向SIRT2的siRNA，構建SIRT2過表達載體，分別瞬時轉染OSE細胞系HOSEpiC和SOC細胞系HO8910，平板克隆形成實驗和CCK-8實驗研究SIRT2對細胞生長的影響;細胞劃痕實驗考察SIRT2在SOC細胞遷移中的作用; Transwell實驗研究SIRT2 對SOC細胞侵襲能力的影響。結果: 5株SOC細胞系中SIRT2的表達水平顯著低于OSE細胞系。在HOSEpiC細胞中沉默SIRT2，細胞克隆形成數增多，細胞活力增強。相反，在HO8910細胞中過表達SIRT2，細胞克隆形成數減少，細胞活力降低。沉默SIRT2促進HOSEpiC細胞的遷移，而過表達SIRT2則抑制HO8910細胞的遷移。沉默SIRT2的HOSEpiC細胞侵襲能力明顯增加，而過表達SIRT2的HO8910細胞侵襲能力則顯著降低。結論: SIRT2在SOC細胞中表達顯著下調。SIRT2在OSE細胞中是腫瘤抑制蛋白，抑制細胞增殖、遷移和侵襲。

［關鍵詞］SIRT2蛋白;漿液性卵巢癌;細胞增殖;細胞遷移;腫瘤侵襲

SIRT2是人類的III類組蛋白脫乙酰酶，在組織中存在廣泛表達，參與細胞的正常生理或病理生理過程［1-2］。既往研究表明，SIRT2表達水平與癌癥密切相關，但根據細胞來源和腫瘤類型的不同，SIRT2分別扮演著腫瘤抑制因子或腫瘤促進因子的角色。

卵巢上皮性腫瘤來源于卵巢表面的生發上皮，而生發上皮來自原始的體腔上皮，具有分化為各種苗勒上皮的潛能，若向輸卵管上皮分化，則形成漿液性腫瘤。上皮性卵巢癌約占卵巢惡性腫瘤的98%，其中75%的上皮性卵巢癌為漿液性卵巢癌( serousovarian carcinoma，SOC)。目前關于SIRT2在SOC中的研究尚未有報道，本研究旨在明確SOC中SIRT2的表達水平并進一步揭示SIRT2對SOC的生長、遷移和侵襲等惡性生物學行為的影響。

材料和方法

1主要材料

人卵巢表層上皮( ovarian surface epithelium，OSE)細胞系HOSEpiC購自ATCC;人SOC細胞系SKOV-3、OVCAR433、HEY、CAOV3和HO8910均購自中國科學院細胞庫。

細胞轉染試劑Lipofectamine 3000購自Invitrogen;細胞DMEM培養基、RPMI-1640培養基、胎牛血清和0.25%胰酶-0.02% EDTA購自Gibco; SIRT2兔抗人I抗和β-actin鼠抗人I抗均購自Abcam; CCK-8試劑盒購自Dojindo; Matrigel購自BD; Transwell小室購自Millipore; siRNA由上海吉瑪基因技術有限公司設計合成。

2實驗方法

2.1細胞培養HOSEpiC、SKOV-3和OVCAR433細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，HEY、CAOV3和HO8910細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，常規培養于5% CO2、37℃的培養箱。

2.2Western blot實驗提取各細胞系總蛋白，BCA法測蛋白濃度，按每孔30 μg蛋白上樣。恒壓80 V電泳，恒壓100 V轉膜100 min，10%脫脂奶粉液封閉30 min，I抗4℃過夜，II抗室溫孵育1 h后ECL發光顯影。

2.3過表達載體的構建和細胞轉染HO8910細胞提取總RNA，逆轉錄獲得cDNA，以其為模板進行PCR擴增，切膠回收后，構建重組質粒pCMV-Myc，轉化DH5α感受態大腸桿菌，挑選轉化子，提取質粒，經酶切和測序鑒定。按照Lipofectamine 3000說明書操作，按照質粒或siRNA∶脂質體比例為1∶1.5轉染細胞。

2.4克隆形成實驗將轉染8 h后的各組細胞消化收集，按每孔1 000個將細胞接種于12孔板中，每2～3 d換液，7 d后取出固定并用結晶紫染色，顯微鏡下計數大于10個細胞的克隆數。

2.5CCK-8實驗將轉染24 h后的各組細胞消化收集，按照每孔5 000個將細胞接種于96孔板中，分別在不同時點( 0、12、24、36、48、60和72 h)加入10 μL CCK-8試劑，37℃孵育1 h，在450 nm處測定各孔的吸光度( A)值，相對細胞活力( %) = (各組不同時點A值－空白孔不同時點A值) /(各組起點A值－空白孔不同時點A值)×100%。

2.6細胞劃痕實驗( wound-healing assay)將細胞按照每孔4×105個接種于6孔板中，轉染48 h后，細胞融合度達95%以上，用無菌Tip頭部劃線，PBS清洗去除細胞碎片，加入無血清培養基，5% CO2、37℃培養，不同時點( 0和48 h)顯微鏡下觀察并拍攝細胞向劃痕區的遷移情況。

2.7Transwell侵襲實驗將轉染24 h的各組細胞消化收集，用無血清培養基重懸，按每孔1×105個細胞( 150 μL)加入到預鋪好Matrigel的Transwell小室內，下室加入600 μL完全培養基，培養36 h后棉簽擦掉上室細胞，甲醇固定30 min，0.1%結晶紫染色30 min，顯微鏡下隨機取5個高倍視野計數穿膜細胞數，取平均值。

3統計學處理

本研究中的所有實驗數據均采用統計軟件SPSS 18.0進行分析。計量資料用均數±標準差( mean± SD)表示，組間差異比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

結果

1 SIRT2在漿液性卵巢癌細胞系中的表達

我們對6株卵巢(癌)上皮細胞系的SIRT2表達水平進行了檢測，這6株細胞系分別為OSE細胞系HOSEpiC細胞以及SOC細胞系HEY、HO8910、OVCAR-433、CAOV3和SKOV3細胞。Western blot結果顯示SOC細胞系中SIRT2表達水平顯著低于OSE細胞系( P＜0.01)，見圖1。

Figure 1.The protein expression of SIRT2 in OSE cell line and SOC cell lines.Mean±SD.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs HOSEpiC.圖1　SIRT2在OSE細胞系和SOC細胞系中的表達情況

2 在HOSEpiC細胞中沉默內源性SIRT2或在HO8910細胞中過表達SIRT2

在SIRT2高表達的HOSEpiC細胞中分別轉染靶向SIRT2的干擾RNA: siRNA1～3，均可顯著下調內源性SIRT2的表達( P＜0.01) ;而SIRT2低表達的HO8910細胞轉染pCMV-SIRT2-Myc載體，則可以顯著增加細胞內的SIRT2表達水平( P＜0.01)，見圖2。

Figure 2.Knockdown or overexpression of SIRT2 in the ovarian cell lines.Mean±SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs scramble;##P＜0. 01 vs SIRT2-Myc.圖2　在卵巢(癌)細胞系中沉默或過表達SIRT2

3 SIRT2對卵巢(癌)細胞增殖能力的影響

我們分別利用平板克隆形成和CCK-8實驗觀察沉默SIRT2或過表達SIRT2對細胞增殖的影響。平板克隆形成結果顯示，沉默SIRT2促進OSE細胞系HOSEpiC的惡性增殖( P＜0.05)，而過表達SIRT2則對SOC細胞系HO8910的增殖有顯著抑制作用( P＜0. 01)。CCK-8實驗發現細胞活力的改變與平板克隆形成實驗一致，見圖3。

Figure 3.The effect of SIRT2 knockdown or overexpression on ovarian cell proliferation.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05 vs SIRT2 si-RNA-2;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs SIRT2-Myc.圖3　沉默或過表達SIRT2對卵巢(癌)細胞增殖的影響

4 SIRT2對卵巢(癌)細胞遷移能力的影響

為進一步研究SIRT2對卵巢(癌)細胞遷移的作用，我們利用劃痕實驗分別觀察沉默SIRT2或者過表達SIRT2對HOSEpiC和HO8910細胞遷移率的影響。我們發現，SIRT2顯著抑制細胞的遷移，而沉默SIRT2則會導致細胞遷移率顯著增加( P＜0.01)，見圖4。

Figure 4.The effect of SIRT2 knockdown or overexpression on ovarian cell migration.Mean±SD.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs SIRT2 si-RNA-2;##P＜0. 01 vs SIRT2-myc.圖4　SIRT2對卵巢(癌)細胞遷移能力的影響

5 SIRT2對卵巢(癌)細胞侵襲能力的影響

我們發現，沉默SIRT2的HOSEpiC細胞侵襲能力顯著提高( P＜0.05)，而過表達SIRT2的HO8910細胞侵襲能力受到抑制( P＜0.01)，見圖5。以上結果提示，SIRT2表達的下調是造成SOC轉移的關鍵因素之一。

討論

卵巢癌是女性生殖器官三大惡性腫瘤之一，其中上皮性卵巢癌最為常見，其發病隱匿，進展迅速，病死率居婦科惡性腫瘤之首，在女性的死因中位于第5位［3］。

SIRT2是sirtuin家族重要的成員之一，介導組蛋白和非組蛋白的去乙酰化修飾，主要功能是維持基因組的穩定性，修復DNA損傷，調控有絲分裂，參與抗氧化應激及炎癥反應，抗凋亡損傷等病理生理過程［4-7］。有研究證實，SIRT2參與癌癥的發生和進展過程，且具有細胞來源或腫瘤類型的特異性。SIRT2在神經膠質瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、食管腺癌、胃癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌中低表達，而在急性髓性白血病、神經母細胞瘤、胰腺癌、肝細胞肝癌等腫瘤中高表達［8］。雖然SIRT2在多種腫瘤中的促癌或抑癌功能已被闡明，但SIRT2與SOC的關系尚未明確。我們的研究結果首次證實SIRT2在SOC細胞系中表達水平較OSE細胞系顯著降低。我們推測SIRT2在卵巢癌中扮演著抑癌基因的角色，SIRT2表達下調是SOC發生的重要分子事件。

惡性增殖、侵襲和轉移等是腫瘤難以治愈的重要因素。有研究表明，SIRT2的表達水平與腫瘤的上述惡性生物學行為密切相關，如SIRT2基因沉默后顯著抑制了肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力［9-11］;在肺癌細胞系中過表達SIRT2則可以調節細胞增殖、凋亡及細胞周期［12-13］;同樣，過表達SIRT2能顯著抑制神經膠質瘤細胞的增殖以及克隆形成［14-15］。我們的研究結果顯示，在高表達SIRT2的OSE細胞系HOSEpiC細胞中沉默SIRT2可以導致細胞克隆形成增多，增殖加快，同時細胞的遷移和侵襲能力增強;相反，在低表達SIRT2的SOC細胞系HO8910細胞中過表達SIRT2可以抑制細胞克隆形成和增殖速率，對細胞的遷移和侵襲也有顯著的抑制作用。以上研究結果進一步證實，SIRT2在OSE中作為腫瘤抑制蛋白發揮抑癌作用，SIRT2表達水平降低是SOC惡性增殖、遷移和侵襲能力增加的關鍵因素之一。

近些年來，分子靶向藥物在臨床實踐中取得顯著療效，將癌癥治療推向了一個前所未有的新階段，然而SOC沒有特異的生物標志物和治療靶標。我們的研究結果將對卵巢癌的個體化靶向治療提供新的分子生物學依據。

Figure 5.The effect of SIRT2 knockdown or overexpression on ovarian cell invasion.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05 vs SIRT2 siRNA-2;##P＜0. 01 vs SIRT2-Myc.圖5　SIRT2對卵巢(癌)細胞侵襲能力的影響

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Reduced expression of SIRT2 in serous ovarian carcinoma promotes cell proliferation，migration and invasion

DU Yan-hua1，2，ZHANG Hai-yan1，SUN Hong1
(1Obstetrics＆Gynecology Hospital of Fudan University，2Shanghai Key Laboratory of Female Reproductive Endocrine Related Diseases，Shanghai 200011，China.E-mail: hongsun57@ hotmail.com)

［ABSTRACT］AIM: To compare the expression of SIRT2 in ovarian surface epithelial ( OSE) cell line and serous ovarian carcinoma ( SOC) cell lines，and to investigate the effects of SIRT2 on the cell proliferation，migration and invasion.METHODS: The expression levels of SIRT2 in the OSE cell line and the SOC cell lines were determined by Western blot.The SIRT2 siRNAs and overexpression construct were designed and verified.Transient transfection of SIRT2 siRNAs or overexpression construct was performed，and the effect of SIRT2 on the cell proliferation，migration and invasion was evaluated.RESULTS: SIRT2 levels in the 5 strains of SOC cell lines were significantly lower than that in the OSE cell line.SIRT2 knockdown in HOSEpiC cells significantly enhanced the ability of cell colony formation and accelerated the cell growth rate.On the contrary，overexpression of SIRT2 in HO8910 cells dramatically repressed the number of cell colonies and cell activity.SIRT2 significantly changed the ability of ovarian cell migration.Knockdown of SIRT2 facilitated the cell invasion.CONCLUSION: The expression of SIRT2 in the SOC cells is significantly down-regulated.In the OSE cells，SIRT2 acts as a tumor suppressor and mediates the inhibition of cell proliferation，migration and invasion.

［KEY WORDS］SIRT2 protein; Serous ovarian carcinoma; Cell proliferation; Cell migration; Neoplasm invasion

通訊作者△Tel: 021-33189900; E-mail: hongsun57@ hotmail.com

*［基金項目］上海市科學技術委員會科研計劃( No.14ZR1404100)

［收稿日期］2015-05-04［修回日期］2015-05-26

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1209-05

［中圖分類號］R730. 23; R737. 31

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.010