細(xì)胞內(nèi)自由基的類型及產(chǎn)生機(jī)制

方幟　薛波　劉龍洲等

摘要 自由基的過(guò)度產(chǎn)生是機(jī)體過(guò)氧化損傷、代謝紊亂和抗氧化失衡的主要原因。該研究主要闡述了自由基的類型和產(chǎn)生機(jī)制，同時(shí)闡明了動(dòng)物骨骼肌和消化道自由基的來(lái)源。

關(guān)鍵詞 自由基；類型；產(chǎn)生機(jī)制

中圖分類號(hào) S8-0 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）15-020-03

Free Radical Types in Cells and Generation Mechanism

FANG Zhi， XUE Bo， LIU Longzhou， YANG Ye*

（College of Animal Science， Yangtze University， Jingzhou， Hubei 434025）

Abstract The overproduction of free radical is the main reason of peroxidation damage， metabolic disturbance and antioxidant imbalance. The types and generation mechanism of free radical were elaborated， as well as source of free radical in muscle skeleton and digestive tract in animal.

Key words Free radical； Type； Generation mechanism

自由基（Free radical，F(xiàn)R）通常指獨(dú)立存在的帶有未成對(duì)電子的原子、原子基團(tuán)、分子或離子。自由基不僅是需氧生物體在正常條件下的新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生，而且在受到各種刺激因子（環(huán)境溫度、機(jī)械、病原）的作用下會(huì)在短時(shí)間內(nèi)大量產(chǎn)生。機(jī)體內(nèi)大量自由基的產(chǎn)生是動(dòng)物應(yīng)激和亞健康、生產(chǎn)性能下降的主要原因。

1 自由基的類型

自由基是細(xì)胞內(nèi)通過(guò)失去一個(gè)電子或得到 一個(gè)電子而產(chǎn)生。這些自由基通常是在細(xì)胞融合、細(xì)胞裂解或氧化還原反應(yīng)的過(guò)程中產(chǎn)生帶電或不帶電的自由離子。活性氧（ROS）不僅包括氧中心自由基，而且包括氧的反應(yīng)衍生物的非自由基（如H2O2）。活性氮（RNS）是指氮自由基和其他反應(yīng)分子。這些分子中含有氮。因此，活性氧氮分子（RONS）是ROS、RNS的總稱，包括自由基和非自由基。

細(xì)胞內(nèi)主要的自由基是過(guò)氧化物（O-2·）和一氧化氮（NO）。O-2·是在電子傳遞系統(tǒng)中氧的不完全還原反應(yīng)產(chǎn)生或作為酶系統(tǒng)的特殊產(chǎn)物；而NO是有酶促反應(yīng)產(chǎn)生。O-2·和NO都具有活性，能很容易地反應(yīng)生成其他ROS和RNS[1]。以下是一些主要的ROS和RNS及其副產(chǎn)物。

O-2·帶負(fù)電，不容易透過(guò)細(xì)胞膜，一般是體內(nèi)生化反應(yīng)的中間產(chǎn)物。與其他自由基相比，O-2·活性相對(duì)較低，但是它能快速地與NO和蛋白質(zhì)里的FeS基團(tuán)作用。作為具有氧化反應(yīng)活性的離子，O-2·能還原一些生物物質(zhì)（如細(xì)胞色素C），氧化一些物質(zhì)（如抗壞血酸）。細(xì)胞內(nèi)O-2·的歧化作用（如自發(fā)的和過(guò)氧化物歧化酶催化的）可以產(chǎn)生一些過(guò)氧化氫（H2O2）。

1.2 H2O2

H2O2是一種非自由基ROS，能產(chǎn)生自由基如羥基自由基（OH·）。H2O2比較穩(wěn)定，能穿過(guò)細(xì)胞膜，且具有較長(zhǎng)的半衰期，其氧化性比較弱，但在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的氧化性很高。過(guò)氧化氫歧化酶和氨基酸氧化酶產(chǎn)生的H2O2不能直接氧化DNA或脂質(zhì)，但能使一些酶失活[2]。H2O2毒性主要是它能通過(guò)金屬催化反應(yīng)產(chǎn)生OH·，如Fenton反應(yīng)。

H2O2+Fe2+→Fe3++ OH·+ OH-

從細(xì)胞生物學(xué)來(lái)說(shuō)，這個(gè)反應(yīng)是HaberWeiss反應(yīng)非常重要的一部分。由于Fe或Cu通過(guò)過(guò)氧化物保持一種還原狀態(tài)，催化H2O2形成羥基自由基。

O-2·+ H2O2金屬催化OH·+ OH-+O2

即如下細(xì)胞反應(yīng)：

1.3 OH·

OH·具有強(qiáng)氧化性和強(qiáng)反應(yīng)性。因此，OH·能損害與其緊密接觸的分子。它們具有很高的反應(yīng)性，不能穿過(guò)細(xì)胞膜，是對(duì)生物物質(zhì)最具破壞性的ROS。

1.4 單線態(tài)氧（Singlet oxygen）

單線態(tài)氧是一種電子活性氧，但不是自由基。它不含有未配對(duì)電子，具有很短的半衰期，但具有擴(kuò)散性，易穿過(guò)細(xì)胞膜。單線態(tài)氧存在于2種形態(tài)：①第一激活狀態(tài)（1ΔgO2）；②具有更高反應(yīng)活性的第二激活狀態(tài)（2∑gO2）。這種ROS沒(méi)有自旋限制，所以其氧化穩(wěn)定性很高。生物系統(tǒng)中過(guò)氧化陰離子的歧化作用能形成單線態(tài)氧。

1.5 NO

NO在許多細(xì)胞內(nèi)是通過(guò)L精氨酸而形成的。這個(gè)合成作用通過(guò)神經(jīng)NOS（nNOS）、內(nèi)皮細(xì)胞NOS（eNOS）、誘導(dǎo)性NOS（iNOS）3種NO合成酶（NOS）。每種NOS都能在NADPH作用下把L精氨酸轉(zhuǎn)化為NO和L瓜氨酸。

NO能結(jié)合過(guò)渡態(tài)金屬，細(xì)胞內(nèi)其主要作用是具有結(jié)合鳥(niǎo)甙酸環(huán)化酶中的Fe離子的能力。它激活鳥(niǎo)甙酸環(huán)化酶，促進(jìn)cGMP的產(chǎn)生。NO與Fe的結(jié)合是NO發(fā)揮作用的重要機(jī)制，同時(shí)通過(guò)結(jié)合血紅蛋白中的鐵使其在失活和消除的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。NO具有弱還原性，能與氧反應(yīng)形成NO2，與過(guò)氧化物快速反應(yīng)形成亞硝酸鹽[3]。

1.6 亞硝酸鹽（Peroxynitrite）

O-2·與NO反應(yīng)形成亞硝酸鹽，其速度比O-2·的歧化作用形成H2O2的速度快3倍，甚至比NO與血紅素蛋白的反應(yīng)速度還快。這是NO與O-2·存在時(shí)的主要反應(yīng)。亞硝酸鹽（或其質(zhì)子化產(chǎn)物ONOOH）具有強(qiáng)氧化性，能導(dǎo)致氫硫基的損耗、DNA損害和蛋白質(zhì)的硝化。

O-2·+NO·→ONOO-

1.7 超氯化物（Hyperchlorite）

超氯化物是H2O2在過(guò)氧化物酶的作用下形成的。超氯化物一般通過(guò)嗜中性白細(xì)胞形成，通過(guò)氧化氫硫基、脂質(zhì)、抗壞血酸而產(chǎn)生第二產(chǎn)物，對(duì)許多生物活性分子具有破壞作用。另外，其酸性形式（如次氯酸）能穿過(guò)細(xì)胞膜，促使蛋白質(zhì)的破裂和聚集。

H2O2+Cl-→HOCl+ OH-

2 骨骼肌自由基和過(guò)氧化物的產(chǎn)生機(jī)制

肌纖維內(nèi)的不同細(xì)胞部位都會(huì)產(chǎn)生O-2·。不論是肌肉收縮活動(dòng)，還是肌肉延伸活動(dòng)，都會(huì)增加肌纖維里過(guò)氧化物的產(chǎn)量。圖1說(shuō)明了骨骼肌里自由基和O-2·產(chǎn)生的過(guò)程[1]。

2.1 線粒體（Mitochondria）

線粒體是肌纖維ROS產(chǎn)生的主要部位[4]。線粒體消耗了2%～5%的氧，一個(gè)電子還原就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)過(guò)氧化物。最近研究確定了線粒體內(nèi)過(guò)氧化物產(chǎn)生的主要部位。在呼吸鏈復(fù)合物體I系統(tǒng)中，O-2·主要由FeS 復(fù)合物反應(yīng)產(chǎn)生，而在呼吸鏈復(fù)合體II系統(tǒng)中，O-2主要由半醌Q10反應(yīng)產(chǎn)生。在復(fù)合體III系統(tǒng)中，線粒體內(nèi)膜空隙和線粒體基質(zhì)都是釋放O-2·的主要部位。另外，線粒體在基礎(chǔ)呼吸階段（階段4）所產(chǎn)生的ROS量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于在激活呼吸階段（階段3）。與I型肌纖維相比，II型肌纖維能提高ROS產(chǎn)量。II型肌纖維產(chǎn)生ROS的量估計(jì)是I型肌纖維的2～3倍。

2.2 肌質(zhì)網(wǎng)（SR）

骨骼肌NAD（P）H優(yōu)先使用NADH作為底物，NAD（P）H氧化酶在肌肉收縮時(shí)會(huì)釋放過(guò)氧化物，而NAD（P）H氧化酶位于SR。這些酶所產(chǎn)生的ROS能通過(guò)氧化Ryanodine受體而影響SR對(duì)Ca的釋放。

2.3 橫肌束（Transverse tubules）

骨骼肌橫肌束含有NAD（P）H氧化酶，其活性在去極化后會(huì)增加。在吞噬細(xì)胞中的NAD（P）H氧化酶含有一些亞基單位。這些亞基單位會(huì)釋放O-2·到骨骼肌的細(xì)胞液中。

2.4 肌膜（Sarcolemma）

所有細(xì)胞都含有質(zhì)膜氧化還原體系。該質(zhì)膜產(chǎn)生的電子會(huì)穿越質(zhì)膜，肌膜含有NAD（P）H氧化酶復(fù)合體，在巨噬細(xì)胞中的這些酶都含有4個(gè)亞基（gp91phox、p22phox、p47phox、p67phox），且所有這些亞基都與細(xì)胞膜有關(guān)。

除了NAD（P）H氧化酶，質(zhì)膜上還有其他氧化還原系統(tǒng)。這些系統(tǒng)能把電子從細(xì)胞內(nèi)的還原物轉(zhuǎn)移到胞外的電子受體上。電子從胞質(zhì)NAD（P）H轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜上。這種轉(zhuǎn)移可能是通過(guò)NADH細(xì)胞色素 b5 氧化還原酶，或通過(guò)NAD（P）H醌氧化還原酶（NQO1）。通過(guò)一系列的過(guò)程，細(xì)胞內(nèi)NAD（P）H可以作為基質(zhì)在細(xì)胞表面產(chǎn)生過(guò)氧化物。

2.5 PLA2依賴性過(guò)程

磷脂酶A2（PLA2）分解細(xì)胞膜上磷脂而產(chǎn)生花生四烯酸。花生四烯酸是ROS生成酶如脂肪氧合酶的底物。另外，PLA2的激活可以增加NAD（P）H氧化酶活性。PLA2酶活性的增加可以促進(jìn)肌肉線粒體、細(xì)胞液ROS的產(chǎn)生，并把ROS釋放到細(xì)胞外間隙。Ca依賴性和非依賴性的PLA2都參與肌肉ROS的形成，而Ca非依賴性PLA2（iPLA2）主要促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)氧化物的形成。14 kDa的Ca依賴性PLA2（sPLA2）位于線粒體內(nèi)，在肌肉收縮過(guò)程中促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS的形成。在非骨骼肌細(xì)胞中，另外一種Ca依賴性PLA2異構(gòu)體——細(xì)胞質(zhì)PLA2（cPLA2）與ROS的形成有關(guān)。研究表明，在休息時(shí)，ROS來(lái)自于Ca-非依賴性PLA2，而在肌肉收縮時(shí)，ROS主要來(lái)自于激活的Ca依賴性PLA2。

2.6 黃嘌呤氧化酶（XO）

XO可以增加骨骼肌里ROS的產(chǎn)生。小鼠骨骼肌里含有大量的XO，而人類骨骼肌里黃嘌呤脫氫酶或氧化酶的活性很低。

2.7 NO的產(chǎn)生

在一般情況下，骨骼肌會(huì)表達(dá)NO合成酶（NOS）異構(gòu)形式的神經(jīng)NOS（nNOS）和內(nèi)皮NOS（eNOS）。nNOS在快速收縮肌肌膜處表達(dá)較多，而eNOS多位于肌肉線粒體。在炎性條件下肌肉也會(huì)表達(dá)iNOS，但在正常肌肉中的作用不大。對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞肌管進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)骨骼肌細(xì)胞在收縮活動(dòng)時(shí)釋放的NO增加[5]。

3 動(dòng)物腸道自由基的產(chǎn)生機(jī)制

在細(xì)胞正常新陳代謝和先天免疫反應(yīng)過(guò)程中，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生ROS——自由基。首先，腸上皮細(xì)胞的主動(dòng)新陳代謝本身就是ROS的來(lái)源，其生成與電子傳遞鏈的活性有關(guān)[6]，所產(chǎn)生的活性物質(zhì)包括O-2·、H2O2和OH·。它們都是線粒體中氧化磷酸化過(guò)程中的產(chǎn)物[7]。在線粒體內(nèi)，來(lái)自于底物的電子通過(guò)電子傳遞鏈（ETC）由復(fù)合物I和II（CI和CII）傳遞到氧，形成H2O，并且通過(guò)質(zhì)子泵使得質(zhì)子穿過(guò)線粒體內(nèi)膜。葡萄糖經(jīng)過(guò)三羧酸循環(huán)作用（TCA）產(chǎn)生電子供體。主要的電子供體是NADH，給復(fù)合物I提供電子，另外一個(gè)電子供體是FADH2，給復(fù)合物II提供電子（圖2）。

其次，腸道先天及獲得性免疫系統(tǒng)在與許多共生物和病

原微生物反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的NO。它與O-2·作用產(chǎn)生過(guò)氧亞硝酸陰離子（ONOO-），其較長(zhǎng)的半衰期以及較高的脂溶擴(kuò)散性使得活性氮代謝物的損傷更大[8]。

腸黏膜上皮組織及細(xì)胞受到病原微生物刺激后，會(huì)產(chǎn)生活性氧自由基（ROS）。病菌誘導(dǎo)的腸道細(xì)胞ROS主要是由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶家族（NOX）催化合成，其中主要是NOX1 和雙氧化酶（DUOX）。在腸道受到病原微生物侵染時(shí)，吞噬細(xì)胞細(xì)胞膜中存在的NADPH 氧化酶（還原型輔酶氧化酶）可被激活而急劇產(chǎn)生氧的消耗，并產(chǎn)生一定量的O-2·。除O-2·之外，中性粒細(xì)胞所產(chǎn)生的組織損害因子還有蛋白酶、彈力蛋白酶以及由乳鐵蛋白一鐵所產(chǎn)生的OH·，可使酶類及非酶類的物質(zhì)還原，并且產(chǎn)生反應(yīng)性更高的活性氧（H2O2、OH·、ClO-）。這些ROS會(huì)引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，造成腸黏膜損傷，病原菌釋放游離的尿嘧啶堿基作為信號(hào)分子，通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs），激活腸黏膜上皮細(xì)胞中的DUOX，誘導(dǎo)合成大量ROS[9]。

益生菌也能刺激腸道產(chǎn)生少量的ROS。益生菌的誘導(dǎo)腸道細(xì)胞產(chǎn)生ROS的機(jī)制與致病菌完全不同。它通過(guò)細(xì)胞壁上肽聚糖分子中的N甲酰肽作用于腸黏膜細(xì)胞膜上的甲酰肽受體（FPRs），激活細(xì)胞中的NOX1，合成一定量的ROS[10]。益生菌能夠通過(guò)刺激腸道吞噬細(xì)胞膜上的FPRs，激活NOX2，誘導(dǎo)機(jī)體腸道吞噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS。乳酸桿菌能夠通過(guò)激活NOX1誘導(dǎo)腸道組織產(chǎn)生、釋放ROS。益生菌也能夠通過(guò)產(chǎn)生可溶性蛋白成分，誘導(dǎo)宿主腸道合成一定量的ROS。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年

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