臺盼藍活細胞計數法檢測中藥復方對血管平滑肌抑制作用

王萌 楊曉琨

摘要：目的觀察辛通暢絡中藥復方對慢性腎臟病心血管危險因素的改善作用。方法大鼠按每天15 g/kg劑量，灌胃給藥，連續灌服10（1，于最后一次給藥后2～3h，股動脈放血，分離血清，即為中藥血清，經560C，30 min滅活后，分別配成含10、20、30%中藥血清的培養液備用，以正常大鼠血清為對照。用含辛通暢絡中藥處方不同濃度血清培養血管平滑肌細胞，用臺盼藍活細胞計數法及四甲基偶氮唑藍（MrIr）法分別檢測活細胞數目和細胞生長抑制率。結果 實驗結果顯示：24 h.72 h經不同藥物濃度血清培養后，與對照組相比，培養24 h后，20%藥物組.30%藥物組均較其在統計學上有顯著差異（P<0.01）；培養72 h后培養24 h后，10%藥物組較對照組在統計學上有顯著差異（P<0.05），20%藥物組.30%藥物組均較其在統計學上有顯著差異（Jp<0.01），結論 揭示辛通暢絡中藥復方抑制血管平滑肌細胞增殖，從而防治慢性腎臟病早期動脈粥樣硬化所致的血管重構。

關鍵詞：慢性腎臟病；辛通暢絡中藥復方；血管重構

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1007 - 2349（ 2015） 03 - 0060 - 02

心血管疾病（Cardiovascular disease，CVD）是慢性腎臟病（ chronic kidney disease，CKD）患者中最常見的并發癥，相關資料顯示，CKD病人死于CVD者在其總死亡率中高達30%～50%[1]。目前，如何干預CKD患者的CVD，尚缺乏足夠的循證醫學依據。因此，在中醫藥領域內尋求有效的治療方法和藥物，是基礎與臨床領域面臨的重要課題。依據辛通暢絡中藥復方可以有效改善FSGS大鼠腎臟功能指標，減輕腎臟病理形態學損害，同時辛通暢絡法中藥復方具有調節大血管重構的作用，本實驗通過確定辛通暢絡中藥復方對體外血管平滑肌細胞增殖的影響，以期從細胞、分子水平解析該中藥復方防治動脈粥樣硬化、調節大血管重構減少心血管并發癥的機制，為該復方臨床應用提供更充分的理論依據。1 實驗材料及方法1.1 辛通暢絡中藥復方藥物血清的制備①辛通暢絡中藥復方的組成：柴胡12g，黃芩10g，生黃芪30g，當歸10g，女貞子15g，澤蘭15g，水蛭10g，細辛3g；②上8味藥共煎煮3次，濃縮成100mL，汁液（4g生藥/mL），無菌裝瓶密封，以上各藥均經天津市藥品檢驗所核定；③實驗動物選用Spragoe -DawlPg（ SD）遠交系健康大鼠48只，均為雄性，體重（250 -300）g，SPF/VAF'級，南北京華阜康生物科技股份有限公司提供（合格證號：SCXK京2009 - 0007）；④實驗設備和試劑：實驗設備和試劑：胎牛血清、臺盼藍、四甲基偶氮唑藍、胰蛋白酶、DMEM均由天津子涵生物科技有限公司提供。

實驗方法：大鼠按每天15g/kg劑量，灌胃給藥，連續灌服10天，于最后一次給藥后2～3 h，股動脈放m，分離血清，即為中藥m清，經56℃，30 min滅活后，分別配成含10、20、30%中藥血清的培養液備用，以正常大鼠血清為對照。1.2 血管平滑肌細胞培養和鑒定 用組織貼塊法培養VSMC，經α-actin免疫組化鑒定為VSMC，第3-5代細胞用于實驗。2 實驗生化檢測指標和方法

用臺盼藍活細胞汁數法檢測活細胞數日細胞以1.0×105個/L的密度種于24孔板，培養24h后以無血清DMEM靜息24h，換成8%胎牛血清的DMEM培養液，分為對照組和不同濃度加藥組，每組設6個復孔，培養24 h、72 h后，分別以0. 25%胰蛋白酶消化細胞，取50μL，細胞懸液與50μL0.4%臺盼藍溶液混勻，臺盼藍溶液終濃度為0.2%。取一滴混勻懸液加入血細胞計數板，鏡下計數活細胞數。3統計學分析

實驗數據統計采用SPSS13.0統計學軟件進行分析，各組實驗數據以均數±標準差表示，總體數據進行組間單因素方差分析 （One Way ANOV），顯著性差異水平設定為P<0.05。4實驗結果

實驗結果顯示：24 h、72 h經不同藥物濃度血清培養后，與對照組相比，培養24 h后，20%藥物組、30%藥物組均較其在統計學上有顯著差異（P<0.01）；培養72 h后培養24 h后，10%藥物組較對照組在統計學上有顯著差異（P<0.05），200藥物組、30%藥物組均較其在統計學上有顯著差異（P

揭示辛通暢絡中藥復方抑制血管平滑肌細胞增殖，從而防治慢性腎臟病早期動脈粥樣硬化所致的血管重構6討論

腎臟病患者往往同時存在高血壓、高血脂、蛋白尿、低蛋白血癥、血尿、貧血、鈣磷失調等，戰在慢性腎臟病的早期出脫動脈粥樣硬化和動脈硬化，從而導致血管病變即血管重構。血管重構是指機體在生長、發育、衰老和疾病過程中，血管為適應內、外環境（特別是力學環境）的變化而發生形態、結構和功能的一系列適應性改變，足機體對血流動力學長期改變而發生的一種適應性反應和病理生理學過程[2]，血管重構的中心環節是血管平滑肌細胞的增殖、凋亡和重組。動脈重構是一此心血管疾病共同的重要的病理生理改變和發病基礎，故而抑制動脈重構是減少慢性腎臟病心血管疾病的的重要環節，對降低其發病率和病死率具有重要意義。在慢性腎臟病的早期往往已出現心血管并發癥，其發生率隨腎功能進展而增加，至終末期腎病（ ESRD）時達最高峰。

依據FSGS及其心血管病變足以氣推動力虛損，樞機不利，濕濁瘀毒蘊結，心腎脈絡損傷為基本病機，本課題以辛通暢絡，益氣和血為法，篩選組合既往臨床觀察具有療效優勢的中藥復方為中醫干預觀察藥物。

辛通暢絡中藥復方建立的以疏利少陽法為主，融益氣養陰，清熱利濕，辛通暢絡、活血化瘀為一體的中藥復方制劑。在證實了腎絡寧能有效改善FSCS大鼠腎臟功能指標，減輕腎臟病理形態學損害等實驗結果的基礎上[3]，本研究針對慢性腎臟病患者近半數死于嚴重心血管并發癥的這一嚴重社會問題，探討腎絡寧對防治動脈粥樣硬化、調節大血管重構的作用機制，為減少慢性腎臟病患者心血管并發癥的發生、提高CKD患者生存率和生活質量提供理論依據。

實驗結果表明辛通暢絡中藥復方能夠抑制平滑肌細胞增殖，調節大血管重構，提示腎絡寧具有可推遲動脈硬化、動脈粥樣硬化發生的作用，從而降低心血管疾病的危險性，揭示了該藥物不僅僅是通過改善腎功能異常來減少心血管病發病的危險性，同時本身具有減少慢性腎臟病的心血管疾病的作用，最終提高慢性臟病患者生存率和生活質量。研究辛通暢絡中約復方改善慢性腎臟病心血管疾病的機制及擴大使用范圍奠定基礎。參考文獻：[1] Bleumink GSS，An11dFCS，Miriam CJM，et al.Genetic polymorphism andheart failure. GenetMed ，2004，6（6）：465-474.[2]李元，龔文輝.血管重建及影響因素[J].滁州學院學報，2002，7（1）：117 -120[3]楊曉琨，辛通暢絡法對FSGS腎病大鼠心血管的重構作用及機制研究[博十學位論文].天津：天津中醫藥大學，2010

（收稿日期：2014-10-21）