沙棗植物基因組DNA提取方法的比較

馬昕璐　黃俊華

摘 要：為深入研究沙棗的藥用價值，對比沙棗植物基因組DNA提取的方法，選取SDS法、CTAB法、酚—氯仿法以及試劑盒法4種提取方法，通過瓊脂糖凝膠電泳對所提取DNA進行完整性檢測，通過紫外分光光度法對DNA進行純度、濃度檢測。 結果顯示，試劑盒法提取DNA的A260/A280值嫩葉為1.83，標本葉為1.81，A260/A230值嫩葉為2.31，標本葉為2.26。 研究認為，從純度與完整度觀察分析，試劑盒法為最優(yōu)方法，經濟有效，可在CTAB方法上進行改進。

關鍵詞：沙棗；DNA提取方法；比較

中圖分類號：S665.1 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.09.001

Comparison on Extraction Methods of Genomic DNA of Elaeagnus angustifolia L.

MA Xin-lu，HUANG Jun-hua

（Xinjiang Agricultural University， Urumqi，Xinjiang 830000，China）

Abstract： In order to compare methods of extraction genomic DNA from Elaeagnus angustifolia L. ， four extraction methods including SDS method， CTAB method， phenol-chloroform method and kit method were selected， and extracted DNA were detected by agarose gel electrophoresis， DNA purity were detected using ultraviolet spectrophotometer. The result showed that the A260/A280 numerical value for young leaves was 1.83， speciens leaves was 1.81， the A260/A230 numerical value for young leaves was 2.31， speciens leaves was 2.26. The kit method was the optimal method， in term of economic and effective， and could be modified in the CTAB method.

Key words： Elaeagnus angustifolia L； DNA extraction method； comparison

沙棗（Elaeagnus angustifolia L. ）為胡頹子科胡頹子屬的落葉小喬木，又名桂香柳、七里香等，生長在干旱、半干旱、荒漠、半荒漠地區(qū)，被稱為沙漠里的“寶樹”。在西北地區(qū)是重要的防護林樹種，分布廣泛，沙棗含多種功能保健成分，其藥用價值已成為近年來研究的重點。

據《新疆藥用植物志》記載，沙棗具有“強壯、鎮(zhèn)靜、健胃、止瀉、利尿”的功效[1-3]。沙棗果實、樹皮和花均能入藥[4]，在維吾爾醫(yī)學中，沙棗果實浸出物的濃縮液是民間治療作嘔胃脹的藥方[5]。沙棗莖枝產生的膠汁俗稱“沙棗膠”，可加入消炎、活血、定痛復方中，外用可治療骨折。沙棗葉總提取物對慢性氣管炎、菌痢、冠心病、心律失常有治療作用，對燒傷創(chuàng)面也有一定療效。孫建新[6]發(fā)現(xiàn)沙棗提取物對人胃癌、肝癌、胰島癌細胞株具有直接殺傷作用，能抑制腫瘤細胞增殖。Ahmadiani[7]研究發(fā)現(xiàn)沙棗果實水提物具有顯著的抗炎效果。陶大勇[8]研究發(fā)現(xiàn)沙棗提取物可抑制大腸桿菌的生長繁殖。多里坤·木扎帕爾[9]研究發(fā)現(xiàn)沙棗干粉能夠對嬰幼兒的腹瀉起一定減緩作用，減少大便數(shù)量，促進鹽分的攝入。而皮膚病學研究驗證沙棗花浸膏以及沙棗果實的可食部分提取物能夠促使傷口快速愈合[10]。

沙棗具有較好的藥理活性和保健功能，不同環(huán)境地區(qū)的沙棗以及沙棗種下不同的等級類型具有不同的藥用價值，目前對于沙棗各地區(qū)的種間差異及種下等級的分類雖然也有較多研究，但種的變異較大，不易區(qū)分。所以非常有必要借助分子這一手段，使沙棗種間及種下等級分類更為清晰，更深入研究沙棗的藥用價值，為沙棗的開發(fā)提供相應的理論基礎。而分子研究的基礎物質是DNA，其提取技術成為分子生物學的最基本技術[11]。從植物組織中提取DNA要求簡便、有效、快捷、經濟。但由于沙棗植物組織中含有較多的多糖和其他次生代謝產物（如酚、酯、萜、色素等），這便給高質量的DNA提取帶來了較多的困難[12]，所以選擇更好的植物基因組DNA提取方法是十分有必要的。

1 材料和方法

1.1 材料預處理

試驗葉片于2012年8月，采自新疆烏魯木齊市烏拉泊地區(qū)沙棗植物葉片，一株制作成標本，放入標本夾；一株用蒸餾水洗去塵土，曬干，放入-60 ℃冰箱冷凍備用。

1.2 幾種重要溶液的配制

（1）1 mol·L-1 Tris-HCl 溶液（pH值8.0）。根據其相對分子質量，將12.11 g 的Tris堿溶于80 mL超純水，冷卻至室溫，用濃鹽酸調定pH值至8.0，然后定容至100 mL，分裝后高壓滅菌，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）0.5 mol·L-1 EDTA 溶液 （pH值8.0）。根據其相對分子質量，將18.61 g的 EDTA-Na2·H2O溶于80 mL超純水，然后用固體NaOH調節(jié)溶液pH值至8.0，用水定容至100 mL，分裝后高壓滅菌，室溫保存?zhèn)溆谩?

（3） TE緩沖液（pH值8.0）。根據相對分子質量進行計算，將1 mol·L-1 Tris-HCl（pH值8.0）2.0 mL、0.5 mol·L-1 EDTA（pH值8.0）0.4 mL、超純水197.6 mL依次放入試管混合均勻，然后調溶液pH值至8.0，分裝后高壓滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆茫?00 mL）。

（4）5×TBE（Tris-硼酸）電泳緩沖液。將27 g 的Tris堿，13.75 g的硼酸，加入10 mL 的0.5 mol·L-1 EDTA（pH值8.0），350 mL的蒸餾水，攪拌溶解后，定容至500 mL。由于瓊脂糖凝膠電泳時使用液為0.5×TBE，則需要取配制的5×TBE 500 mL加水定容至5 L即可使用。

（5）SDS提取緩沖液。將1 mol·L-1Tris-HCl（pH值8.0）10 mL、0.5 mol·L-1EDTA（pH值8.0）10 mL、5 mol·L-1NaCl 10 mL、10%SDS 20 mL、100%β-巰基乙醇2 mL、超純水26 mL混勻備用。

1.3 DNA提取方法及步驟

1.3.1 SDS法提取DNA （1）取1.5 mL Eppendorf管，加入600 μL SDS提取緩沖液，1 mL10%SDS溶液，混勻，置于65 ℃水中待用。

（2）取2 g的植物幼嫩葉片或標本葉，70%乙醇清洗，雙蒸水沖洗干凈后，置于研缽中，加入液氮，輕輕搗碎葉片，待液氮將要揮發(fā)完，快速研磨至其完全成為粉狀，把粉末轉移到有標記的1.5 mL無菌Eppendorf管中。

（3）將凍粉加入備用述Eppendorf管中，混勻，65 ℃水浴30 min，每10 min上下翻轉，使反應體系盡量均勻。

（4）向Eppendorf管中加入200 μL 5 mol·L-1 KAc，混勻，置水浴中30 min。

（5）將樣品管置離心機于4 ℃下12 000 r·min-1離心10 min，離心后將上清液小心轉移到另一個新Eppendorf管中。

（6）加入等體積的氯仿/異戊醇，蓋好管蓋后上下顛倒離心管使溶液混勻，再置于離心機12 000 r·min-1離心10 min。

（7）取上清液，加入等體積的異丙醇，蓋好管蓋后上下顛倒離心管使溶液混勻，然后靜置至試管中出現(xiàn)絮狀物。

（8）挑出絮狀物置新Eppendorf管中，加入600 μL 的70%乙醇洗滌沉淀，將沉淀振蕩起數(shù)秒鐘后，12 000 r·min-1離心10 min，去上清液。再重復上述步驟，洗滌沉淀1次。

（9）室溫下放置30 min，使沉淀干燥，加入50 μL TE溶解，置于37 ℃水浴消化30 min，備用。

1.3.2 CTAB法提取DNA （1）取2 g的植物幼嫩葉片或標本葉，70%乙醇清洗，雙蒸水沖洗干凈后，置于研缽中，加入液氮，輕輕搗碎葉片，待液氮將要揮發(fā)完，快速研磨至其完全成為粉狀，把粉末轉移到有標記的1.5 mL無菌Eppendorf管中。

（2）加入650 μL預熱的CTAB提取緩沖液，用力振蕩1～2 min，馬上放入65 ℃水浴鍋中，水浴90 min。其間，每隔15 min用手輕微振蕩3或4次。

（3）從水浴鍋中取出Eppendorf管，自然冷卻至室溫，置于離心機，12 000 r·min-1離心10 min，取上清至新的Eppendorf管中。

（4）在取出的上清中加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1），蓋好管蓋后緩慢上下顛倒混勻后，置于離心機，12 000 r·min-1離心10 min。

（5）將上清液轉移至另一Eppendorf管中，加入等體積氯仿/異戊醇（24∶1），蓋好管蓋后上下顛倒離心管使溶液混勻，再置于離心機12 000 r·min-1離心10 min。

（6）取上清液轉移至另一Eppendorf管中，加入等體積預冷的異丙醇，輕輕上下?lián)u動Eppendorf管，注意觀察DNA將從溶液中析出。

（7）將加入異丙醇的Eppendorf管，-20 ℃放置10 min，取出置于離心機，12 000 r·min-1離心10 min。

（8）可看到白色DNA沉淀時取出，去上清，加入600 μL 的70%乙醇洗滌沉淀，將沉淀振蕩起數(shù)秒鐘后，12 000 r·min-1離心10 min，去上清液。再重復上述步驟，洗滌沉淀1次。

（9）室溫下放置30 min，使沉淀干燥，加入50 μL TE溶解，置于37 ℃水浴消化30 min，備用。

1.3.3 酚—氯仿法提取DNA （1）取2 g的植物幼嫩葉片或標本葉，70%乙醇清洗，雙蒸水沖洗干凈后，置于研缽中，加入液氮，輕輕搗碎葉片，待液氮將要揮發(fā)完，快速研磨至其完全成為粉狀，把粉末轉移到有標記的1.5 mL無菌Eppendorf管中。

（2）加入650 μL預熱的TEN9提取液，混勻，離心管置于65 ℃水浴鍋中，水浴45 min。其間，每隔15 min用手輕微振蕩3或4次。

（3）從水浴鍋中取出Eppendorf管，自然冷卻至室溫，加入與管中的液體等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1），小心混勻，置于離心機，室溫12 000 r·min-1離心10 min，抽提1次，取上清至新的Eppendorf管中。

（4）加入與上清液等體積的氯仿/異戊醇（24∶1），蓋好管蓋后緩慢上下顛倒混勻后，置于離心機，室溫12 000 r·min-1離心10 min，再抽提1次。

（5）取上清液轉移至另一Eppendorf管中，加入2倍體積預冷的異丙醇，置于離心機，12 000 r·min-1離心10 min。將上清液吸出轉移到廢液缸中，加入600 μL 70%乙醇洗滌1～2次后，置于室溫下晾干。

（6）加入700 μL TE，然后置于50 ℃水浴鍋，助溶15 min，取出放置到室溫后，加入1～2 μL的RNase A溶液，37 ℃保溫1 h。

（7）加入與Eppendorf管中等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1），混勻，置于離心機，室溫12 000 r·min-1離心10 min抽提1次，取上清于新Eppendorf管，加入等體積氯仿/異戊醇（24∶1），混勻，室溫，12 000 r·min-1離心10 min，再抽提1次。

（8）取上清，加入2倍體積含1/10體積的3 mol醋酸鈉的無水乙醇，上下顛倒混勻，置-20 ℃沉淀30 min，取出置于離心機，12 000 r·min-1離心10 min。

（9）可看到白色DNA沉淀時取出，去上清，加入75%乙醇600 μL洗滌1～2次。室溫下放置30 min，使沉淀干燥，加入50 μL TE溶解，置于50 ℃水浴消化助溶15 min，備用。

1.3.4 試劑盒法提取DNA 選取天根生化科技（北京）有限公司生產的植物基因組DNA提取試劑盒。

1.4 DNA的檢測方法

1.4.1 瓊脂糖凝版電泳檢測 在1%瓊脂糖（含3μL EB ）凝膠中，加入10×TBE緩沖液，85 V電壓下電泳30 min，比較幾種方法的DNA得率。

1.4.2 DNA樣品的紫外消光值檢測 將提取出的DNA樣品中加入50 μL超純水，混勻后，用石英比色杯在DU（R） 800分光光度計中測定紫外消光值，根據其在260 nm與280 nm這兩個波長處的光吸收值計算出DNA產率，再根據A260/A280判斷出DNA樣品的純度。

DNA樣品的濃度（μg·μL-1）為在260 nm的紫外消光值×核酸稀釋倍數(shù)× 50/1 000。

純DNA樣品 的A260/A280紫外消光值應為1.8，A260/A230值應大于2.0。A260 /A280值大于1.9時，表明有RNA污染；小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質或酚污染。A260/A230值小于2.0時表明溶液中有殘存鹽和小分子雜質，如核甘酸、氨基酸、酚等。

2 結果與分析

2.1 4種不同方法提取的DNA電泳檢測結果

電泳結果顯示：4種方法均可從沙棗植物嫩葉與標本葉中提出DNA，但4種方法提取出來的DNA的純度和質量均有差異。

由圖1可知，SDS法提取DNA效果很不理想，從標本葉和嫩葉中提取的DNA條帶均可看見較亮的RNA帶，說明提取的DNA中含有RNA。點樣孔中可以看到不太明顯的黑色暗沉，這說明DNA中仍然有少量雜質的殘留。尤其是在標本葉中提取的DNA的條帶有明顯的彌散現(xiàn)象，說明在提取DNA過程中有降解的現(xiàn)象，DNA不完整，質量不高。

由圖2可以看出，CTAB法提出的DNA所顯示的條均無明顯的彌散現(xiàn)象，但是比起SDS法提取的DNA條帶，樣孔有明顯的亮點，說明其中含有較多的蛋白質、糖等雜質。這可能是由于在提取過程中抽提次數(shù)不夠而造成大量雜質的殘留，但是通過CTAB法提取的DNA條帶并沒有明顯的彌散現(xiàn)象，說明DNA相對比較完整，沒有降解現(xiàn)象。

由圖3可知，與之前兩種方法的對比，采用酚—氯仿法提取出的DNA的條帶集中，沒有彌散現(xiàn)象，說明在DNA的提取中，保存完整，沒有被降解。點樣孔完全沒有亮點，可以證明DNA純度高，不含有蛋白質等雜質，但是從嫩葉和標本葉中提取的DNA條帶不夠明亮，這可能是其中DNA含量較少的緣故。兩條電泳帶尾部均沒有RNA條帶，說明RNA去除較為干凈，DNA純度較高。

由圖4可知，采用試劑盒法提取出的DNA的兩個條帶都很整齊、清晰，沒有彌散現(xiàn)象，保存完整，點樣孔沒有出現(xiàn)亮點，也沒有拖尾現(xiàn)象，證明DNA純度高，不含有蛋白質、糖類等雜質，提取的DNA條帶明亮集中，DNA的濃度高，兩條電泳帶尾部沒有RNA亮區(qū)，說明RNA去除比較干凈，DNA純度高。

2.2 沙棗植物DNA不同提取方法純度的比較

由表1可知，SDS法嫩葉中所提取DNA的A260/A280小于1.80，說明提取的DNA中混有蛋白質、酚類等雜質，而標本葉中所提取DNA的A260/A280大于1.90，說明提取的DNA有大量RNA的污染，標本葉A260/A230小于2.0，說明提取的DNA中有殘存的小分子雜質。這就可能導致DNA降解而影響完整性和純度，因此，用SDS法提取DNA的純度不高。CTAB法提取沙棗的DNA，A260/A280都略低于1.8，說明提取的DNA含有少量的蛋白質、多糖等雜質。而酚—氯仿法所提取的DNA，A260/A280值在1.80～2.0之間，說明雜質去除的比較干凈，所提取的DNA純度較高，A260/A230的值小于2.0，可能是由于酚仿抽提過程中殘留了部分酚類，在后來的洗滌中并沒有洗干凈。而試劑盒法提取的DNA的A260/A280在1.80左右，A260/A230大于2.0，可以說明試劑盒法提取的DNA比較純凈，純度與濃度也較高。從DNA的顏色來看，酚—氯仿法提取的DNA，雖然A260/A280值都在1.80左右，但是此種方法所提取的DNA帶有深褐色，SDS法與CTAB法提取的DNA也含有少量顏色，試劑盒法提取的DNA顏色殘留較少，這些顏色可能是沙棗植物本身所含的酚類物質氧化所造成的，也可能是所含有的色素沉淀。

綜上所述，從完整性和純度上總體考慮，以上4種方法從沙棗葉片中提取DNA，試劑盒法相對較好，其他方法效果差些。

2.3 沙棗葉片不同儲存條件提取DNA質量的比較

試驗結果表明，此次試驗所采取的兩種材料（嫩葉和標本葉）所提取的DNA質量有一定的差異，其中試劑盒法效果最好，是此次試驗中較為理想的一種方法。就試驗結果對比而言，嫩葉與標本葉提取DNA的效果均不錯，并沒有明顯的差異。說明將葉子制作成標本對其DNA的提取質量并無明顯的差別。在酚—氯仿法試驗中，標本葉的DNA條帶較弱些，DNA質量沒有嫩葉的高，因此，對于這種方法嫩葉的效果會更好些。SDS法中，標本葉有明顯的彌散現(xiàn)象，但是嫩葉卻沒有，CTAB法中嫩葉和標本葉的效果也沒有明顯的差異，只是含有少量的蛋白質與糖類雜質。

3 結論與討論

總的來說，以沙棗植物的嫩葉或標本葉為材料，從簡便、有效的角度來說，試劑盒法提取出的DNA質量是最好的，而SDS法效果最不理想，其DNA有降解的現(xiàn)象，并且混有大量的蛋白質與糖類雜質；就純度的對比而言，酚—氯仿方法稍遜于CTAB的方法。從快捷、經濟角度來說，CTAB方法為最優(yōu)方法，而對于在CTAB中殘存的雜質，適當加入PVP和巰基乙醇能夠有效去除多糖等次生物質[13]，由此而改進的CTAB方法則會成為與試劑盒法一樣的最優(yōu)方法。

從提取效果上對比，從沙棗植物嫩葉與標本葉中提取的DNA質量相差不大，這對于沙棗的保存辦法提供了很好的依據，可以通過曬干葉片制成標本的方法保存葉片，而不用為保證葉片的新鮮而一直保存在低溫中，耗費財力。特別是在野外采集過程中，這更為簡便、經濟。

沙棗植物葉片提取的DNA顯現(xiàn)出不同顏色是木本植物提取 DNA中常見的問題[14]。由于木本植物體內含有較多的酚類、多糖類等次生代謝產物，它們可與DNA結合形成復合物，尤其是酚類物質經過氧化后極易與DNA共價結合引起褐變和DNA的降解[15]，并且影響之后酶切的分析結果[16]。而DNA樣品中殘留的多糖類物質也可能抑制PCR反應的擴增。因此，沙棗植物DNA提取出的良好結果可為后續(xù)進一步的深入研究奠定基礎。

參考文獻：

[1] 陳永強.植物組織DNA提取的一種快速方法[J].遺傳，1979，1（1）：39-40.

[2] Cheng F S， Brown S K， Weeden N F.A DNA extraction protocol form various tissues in woody species[J]. Hort Science， 1997，32 （5）：921-922.

[3] 王雅，周尚臻，李家寅，等.沙棗功能成分及藥理活性研究進展[J].食品工業(yè)學， 2013，34（3）：361-364.

[4] 水棟，徐泉.沙棗仁油的成分分析及清除自由基能力的研究[J]時針國醫(yī)國藥，2014，25（5）：1 058-1 060.

[5] 劉斌，田紅林，孫蕓.沙棗的食用與藥用價值研究進展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2011， 8（7）：161-163.

[6] 孫建新，朱虎虎，肖輝，等，4種新疆植物提取物對人肝癌細胞生長抑制作用的研究[J].新疆醫(yī)科大學學報，2008，31（7）：828-830.

[7] Ahmadiani，Hosseiny J， Semnanian S. Anti-nociceptive and anti-inflammatory effects of Elaeagnus angustifolia fruit extract[J].Journal of Ethno Phamacology，2000，72：287-292.

[8] 陶大勇，李樹偉，應璐，等.沙棗化學成分的提取分離及藥敏實驗[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2005（3）：10-13.

[9] 多里坤·木扎帕爾·吐爾遜娜依·玉山，古麗娜爾·烏拉孜別克.沙棗治療嬰幼兒急性腹瀉病的臨床研究[J].兒科院學雜志，2007，13（1）：18-20.

[10] Bucur L， Negreanu-P T， Giurginca M， et al. Some new Elaeagnus angustifolia L.extracts and the pharmaceutical products antioxidant activities determined by the chemiluminiscence method[J].Revue Roumaine Dechimie ，2008，53（10）： 961-961.

[11] 謝偉，超銀，郭政宏，等.蘭花基因組DNA多態(tài)性RAPD分析[J].湖北農業(yè)科學，2006，4 （1）：24-26.

[12] 周延清.DNA分子標記技術在植物研究中的應用[M].北京：化學工業(yè)出版社， 2005.

[13] 許婉芳.去除頑拗植物DNA提取過程中干擾物質的方法[J].閩西職業(yè)大學學報，2002（3）：55-57.

[14] 林智華，林程忠，梁紅，等.獼猴桃基因組DNA提取的研究[J].安徽農業(yè)科學， 2009，27（3）：996-998.

[15] 王玲玲，葉青雷，王學英，等.櫟屬植物DNA提取方法的研究[J].沈陽農業(yè)大學學報， 2008，39（6）：737-739.

[16] 侯艷霞，湯浩茹，張勇，等.基因組學與應用生物學[J].安徽農業(yè)科學，2009，28（1）：94-100.