“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)”的教學設計與實施

張大海

摘 要 通過實施“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)”教學，讓學生學會微生物的選擇培養(yǎng)、分離、計數(shù)等技術的原理和方法，理解選擇性培養(yǎng)基和鑒別性培養(yǎng)基的作用。

關鍵詞 微生物分離 選擇

1 教材分析與課時安排

“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)”是人教版高中生物（選修1）專題2“微生物的培養(yǎng)與應用”的第二個課題，學生已學習了有關培養(yǎng)基和無菌技術的基本知識，在掌握使用平板劃線法和稀釋涂布法、分離和純化微生物的實驗操作的基礎上，研究培養(yǎng)基對微生物的選擇作用，并測定其數(shù)量。其中既有關于特定菌株的選擇策略等知識性內(nèi)容，又有土壤溶液的稀釋、菌落數(shù)量統(tǒng)計等操作性內(nèi)容，難度較大、探究性較強，是培養(yǎng)學生設計實驗、動手操作等科學探究能力，提高生物科學素養(yǎng)的好素材。

本課題教學實施中的關鍵在于兩點：① 教師要處理好知識性內(nèi)容與操作性內(nèi)容的關系，要讓學生理解特定菌株的選擇策略，并學習有關的實驗方法和操作程序;② 處理好課常與課后的關系。本課題的實驗操作時間不長，但是操作前要制備培養(yǎng)基、對培養(yǎng)基和其他操作用具進行滅菌，操作后的培養(yǎng)時間和對微生物進行觀察則需要較長時間，因此需要教師精心設計教學程序，統(tǒng)籌安排教學時間。

根據(jù)這一教材特點，本課題教學可分2個課時進行，2個課時之間應留有2 d左右的間隔，以便進行微生物的培養(yǎng)與觀察。

2 教學目標

2.1 知識目標

簡述稀釋涂布平板法分離微生物和進行微生物計數(shù)的實驗原理;說出選擇性培養(yǎng)基和鑒別性培養(yǎng)基的用途;歸納分離純化微生物的原理和方法。

2.2 能力目標

學會制備土壤樣本稀釋液，學會用稀釋涂布法將菌樣液接種到固體培養(yǎng)基平板;學會用稀釋涂布平板法進行微生物數(shù)量測定的方法。

2.3 情感、態(tài)度與價值觀目標

體驗科學知識的形成過程，加深對科學本質(zhì)的理解;體會在實驗活動中合作學習的有效性，養(yǎng)成嚴謹?shù)目茖W態(tài)度。

3 教學準備

3.1 土壤樣品的采集以及土壤溶液的配制

為保證實驗取得預期效果，應選擇經(jīng)常施用尿素的農(nóng)田，鏟去表土后采集3～8 cm深度范圍內(nèi)的土壤;回實驗室后，去除土壤中的植物枯枝敗葉及其他雜物，用托盤天平稱取樣品10 g，加入到盛有90 g無菌水的錐形瓶中，震蕩10 min，即制得101土壤溶液;制備完成后可置于冰箱冷藏室內(nèi)備用（1～2 d）。

3.2 配制培養(yǎng)基并進行高壓蒸氣滅菌

配制牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（配方：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，加熱溶解后，加水定容至1 000 mL。如條件具備可用瓊脂糖代替瓊脂）， 分裝到100 mL 帶棉塞的錐形瓶中，每瓶各25 mL。

配制尿素固體培養(yǎng)基（配方：葡萄糖10 g，尿素1 g，KH2PO4 1.4 g，Na2HPO4 ?2.1g，MgSO4·7H2O 0.2 g，瓊脂15 g，加熱溶解后定容至1 000 mL），分裝到100 mL 帶棉塞的錐形瓶中，每瓶各25 mL。

將上述分裝好的兩種培養(yǎng)基、裝有4.5 mL 蒸餾水的帶棉塞試管、裝有99 mL 蒸餾水的250 mL錐形瓶、包裝好的培養(yǎng)皿進行高壓蒸氣滅菌。

4 教學過程

4.1 導入新課

教師講解：尿素是動物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝終產(chǎn)物，也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的化肥，但農(nóng)作物并不能直接吸收利用尿素，而有些土壤微生物能產(chǎn)生并分泌脲酶。通過分解土壤中的尿素為自身和植物生長提供氮元素，由此引出課題：在特定的土壤中可以分解尿素的微生物的數(shù)量是多少？如何從土壤中的眾多微生物中分離出能分解尿素的微生物？

4.2 分析原理，學生嘗試進行實驗設計

教師介紹Taq細菌的發(fā)現(xiàn)和選擇過程，引導學生認識到研究微生物的分離和培養(yǎng)，是研究微生物利用的基礎，而要選擇出符合需要的特定微生物，則要從微生物的生理和代謝特點出發(fā)，創(chuàng)造有利于目的菌株生長的條件，同時抑制或阻止其他微生物的生長。在此基礎上，教師引導學生提出實驗的初步設想，以尿素為惟一氮源，配制培養(yǎng)基，阻止不能利用尿素的微生物的生長，從而篩選出分解尿素的微生物。學生以實驗小組為單位進行實驗設計。由于本實驗的綜合性強，難度大，學生在設計實驗流程時可能存在不少困難。教師一方面要鼓勵小組內(nèi)部開展討論，逐步修正設計;另一方面也要適時的參與到各組的討論過程中，提出合理的建議。

4.3 總結設計結果，得出可行的實驗流程

讓各小組展示設計結果，組織全體學生討論，教師給予評價，最終得出可行的實驗流程（圖1），并要求學生明確各步驟的具體目的。根據(jù)教師課前所進行的預實驗，所取的土壤樣品中分解尿素的微生物大約為1.5×108個/g。因此，可選擇讓學生進行104、105兩種土壤稀釋液的涂布接種。這樣既可保證實驗效果，又減少了器材、試劑的用量，節(jié)約教學時間，提高教學效率。同時，以牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)作為實驗對照，以便讓學生充分理解和認識選擇性培養(yǎng)基的設計策略和選擇效果。

4.4 學生分組操作

為節(jié)約教學時間，教師可在課前將前期備好的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基，用電磁爐加熱融化后，于課前置于80 ℃的水浴中進行保溫，保持融化狀態(tài)，以便學生及時取用。

倒平板：將融化的兩種培養(yǎng)基分發(fā)給每個實驗小組，指導其按規(guī)范倒平板，將兩種融化的固體培養(yǎng)基倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，每個100 mL錐形瓶中盛有的25 mL培養(yǎng)基，可倒兩個平板，每個實驗組可制得兩種平板共四個。制作完成后，分別編號，置于實驗臺上等待其冷卻凝固。

配制104、105土壤稀釋液：將101土壤溶液和經(jīng)滅菌的裝有4.5 mL 蒸餾水的帶棉塞試管、裝有99 mL 蒸餾水的250 mL錐形瓶分發(fā)給各小組，教師指導學生制備104、105兩種土壤稀釋液。具體的方法可由教師直接給出，也可由各小組自行討論制定方法，因?qū)W生對微量移液器的使用不熟悉，教師應給予指導。

接種菌液，分離尿素分解菌：教師指導學生用微量移液器，各取0.1 mL104、105土壤稀釋液，分別加入到裝有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，使用涂布器，在酒精燈火焰附近打開培養(yǎng)皿，將加入的菌液均勻涂布于整個培養(yǎng)基，蓋上培養(yǎng)皿后，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

以上為第一課時。在第二課時教學實施前，教師可組織學生定期觀察培養(yǎng)情況。

觀察對比培養(yǎng)結果并計算：2 d后觀察比較牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基中菌落的形態(tài)并計數(shù)?？梢悦黠@地發(fā)現(xiàn)，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)多樣，數(shù)目較多，而且隨稀釋倍數(shù)的增加，菌落的數(shù)目減少。而尿素培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)比較單一，數(shù)目也明顯少于對應稀釋倍數(shù)的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落。學生根據(jù)計數(shù)結果，計算出土壤中分解尿素的微生物的數(shù)量。例如學生計數(shù)在105稀釋倍數(shù)的培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落為60個，則每克土壤中尿素分解菌數(shù)量為60×5×105×10=3×108個/g。

4.5 小組討論，促進學生對微生物選擇性培養(yǎng)的理解

學生完成分組操作后，教師可設計問題，引導學生鞏固有關微生物培養(yǎng)的原理和方法，加深其對微生物選擇性培養(yǎng)的理解。具體問題及設計意圖如下：

（1） 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，提供碳源和氮源的物質(zhì)分別是什么？

（2） 尿素固體培養(yǎng)基中，提供碳源和氮源的物質(zhì)分別是什么？

（3） 你所在的實驗小組的培養(yǎng)結果如何？按生長菌落的多少，將4只培養(yǎng)皿排序，從多到少的順序是什么？為何會出現(xiàn)菌落數(shù)量的差異？

（4） 你所在的實驗小組，實現(xiàn)了對土壤中分解尿素的微生物的選擇性培養(yǎng)嗎？為什么？

以上問題串從復習上一課題介紹的微生物培養(yǎng)過程中的碳源、氮源入手，讓學生體會不同微生物在生長過程中利用的碳源和氮源是不同的，從而引導其深刻理解微生物的選擇性培養(yǎng)的思路，進一步掌握特定微生物的選擇和分離的方法。

4.6 設計“意外”，引導課題延伸

教師展示學生的實驗結果，從中選擇符合實驗預期的尿素固體培養(yǎng)基，打開培養(yǎng)皿，使用手持式噴壺，向培養(yǎng)基表面噴入事先配好的質(zhì)量分數(shù)為0.1%的酚紅試劑，靜置片刻，讓學生觀察現(xiàn)象。

教師講解并提問：酚紅試劑是一種酸堿指導劑，其變色范圍是pH6.8（黃）～8.4（紅），觀察到的培養(yǎng)基上的顏色有何變化？這說明了什么問題？

學生通過觀察可知，在培養(yǎng)基上出現(xiàn)了兩種不同類型的菌落，一種菌落周圍出現(xiàn)了紅色圈，另一種則呈現(xiàn)黃色。這說明這些微生物的種類是不同的，菌落周圍變紅的說明微生物培養(yǎng)過程中產(chǎn)生了堿性物質(zhì)，而菌落周圍變黃則說明產(chǎn)生了酸性物質(zhì)。

教師給出如下資料，指導學生閱讀：

資料：微生物將含氮有機物分解產(chǎn)生氨的過程被稱為氨化作用。能進行氨化作用的細菌統(tǒng)稱氨化細菌。有些氨化細菌能分泌脲酶，可將尿素分解生成氨，為微生物提供氮源，如脲芽孢八疊球菌。

硝化細菌可利用氨氧化過程中釋放的能量，將無機物轉化成有機物而營自養(yǎng)生活，其中能將氨氧化成亞硝酸鹽的稱為氨氧化細菌，如亞硝化單胞菌;能將亞硝酸鹽氧化為硝酸的是亞硝酸氧化細菌，如硝化桿菌等。

教師要求學生根據(jù)以上資料，進一步判斷培養(yǎng)基上出現(xiàn)的兩類菌群，分別是資料所給出的哪一類細菌。

在此基礎上，教師提出問題：本實驗中使用的尿素固體培養(yǎng)基中的惟一氮源是尿素，其目的在于選擇土壤中的分解尿素的微生物，那么為何在培養(yǎng)基中出現(xiàn)了以氨為氮源的氨化細菌？如果想進一步選擇分解尿素的微生物應該怎么做？

筆者設計這一問題串的目的在于幫助學生理解選擇性培養(yǎng)基和鑒定性培養(yǎng)基的用途。借此問題，教師引導學生認識到，尿素分解菌可將尿素分解為氨，這時培養(yǎng)基中的氮源的種類就發(fā)生了變化，由原來的尿素是惟一氮源變成了除尿素外還存在其他的氮源。因此，可在這樣的培養(yǎng)基上生長的細菌，有些是可以分解尿素的，有些則是以氨為氮源的雜菌。而要想選擇出其中分解尿素的微生物，可在配制尿素固體培養(yǎng)基時加入酚紅起到鑒別作用，然后用滅菌后的接種環(huán)，挑取菌落周圍出現(xiàn)紅色區(qū)域的微生物進行接種培養(yǎng)。

4.7 總結歸納

在總結歸納階段，教師可設計一系列問題，引導學生回顧微生物分離純化的方法和實驗設計的思路，具體問題如下：

（1） 分離純化微生物的方法有哪些？（平板劃線法、稀釋涂布法、選擇培養(yǎng)基分離、鑒別性培養(yǎng)基鑒別后挑取接種）

（2） 本實驗中，為何要設計使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)土壤微生物的步驟？（設置對照，通過比較實驗組和對照組培養(yǎng)基上菌落的數(shù)量和形態(tài)，證明尿素固體培養(yǎng)基的選擇效果）

（3） 要想提高土壤中尿素分解微生物計數(shù)的準確性，應該怎么做？（設置重復，取均值，減少實驗誤差）

（4） 請歸納微生物計數(shù)的方法。（稀釋涂布法、血球計數(shù)板、比濁法等）

以上教學過程充分挖掘了該課題的教學價值，使課程標準中“微生物的分離與培養(yǎng)、微生物計數(shù)、選擇性培養(yǎng)基的選擇作用”等具體要求得到有效落實，同時，該教學過程較好地處理了知識性內(nèi)容與操作性內(nèi)容及課堂與課后的關系，可起到節(jié)約時間，提高教學效率的效果。

參考文獻：

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