大鼠骨髓基質干細胞的體外培養及誘導分化

徐威　貝朝涌　粟謀　陳寧　蔣林彬

[摘要] 目的 觀察全骨髓貼壁培養法培養骨髓基質干細胞的效果。 方法 將4周齡健康SD大鼠脫頸處死后，無菌條件下取出股骨和脛骨，收集骨髓腔細胞懸液，L-DMEM培養基培養，通過全骨髓貼壁培養法將細胞純化傳代，觀察其生長特性，繪制生長曲線。流式細胞儀檢測細胞表面標記物CD29、CD45、CD90并作同型對照，細胞分別向成骨、成脂方向誘導分化，觀察誘導結果。 結果 經全骨髓貼壁培養法培養的SD大鼠BMSCs呈集落狀貼壁生長，鏡下可見細胞成簇生長，類似魚群狀、菊花瓣狀或漩渦狀。BMSCs增殖速度快，細胞形態穩定，生長狀態較好。生長曲線顯示BMSCs符合正常細胞生長特征且生長活躍。流式細胞儀鑒定CD29和CD90呈陽性表達，CD45呈陰性表達。BMSCs能向成骨、成脂方向誘導分化。 結論 全骨髓貼壁培養法簡單易行，可獲得純度高，活性好，性狀均一的骨髓基質干細胞。

[關鍵詞] 骨髓基質干細胞；分離純化；培養；分化；鑒定

[中圖分類號] R414.4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）32-0030-05

[Abstract] Objective To observe the effect of BMSCs through the method of whole bone marrow adherent culture. Methods After 4-weeks-old healthy SD rats were killed by cervical dislocation， the femur bone and tibia bone were taken out under sterile conditions. Marrow cell suspensions were collected then cultured in L-DMEM medium. The method of the whole bone marrow adherent culture was used to passage purified. The growth characteristic was observed and the growth curve was drawn. CD29， CD45， CD90 of the cell surface markers were detected by flow cytometry and made an isotype control. The cells could be induced to differentiate into osteogenic and adipogenic direction respectively and the results were observed. Results Cultured by the method of the bone marrow adherent， the BMSCs of SD rat showed colony adherent growth and other sharp like cell clusters， similar fish，daisy-like petals or whirlpool under microscope. BMSCs had high rate of proliferation， stabilization of morphology and good growth condition. BMSCs showed the growth characteristics of normal cells and actively growing in the growth curve. The expression of CD29 and CD90 were identified positive by flow cytometry. The expression of CD45 showed negative. BMSCs could be induced to differentiate into osteogenic and adipogenic direction， respectively. Conclusion The method of whole bone marrow adherent culture is simple and can get bone marrow stromal cells of high purity， activity， and homogeneous traits.

[Key words] Bone marrow stromal cells； Isolated and purified； Culture； Differentiation； Identification

1976年Friedenstein等[1-4]從骨髓中分離出骨髓基質干細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs），并發現該細胞能在體外大量增殖，貼壁呈集落樣生長，并且具有定向分化的能力。因其取材簡便，克服了部分倫理道德和免疫排斥等問題[5，6]，因此受到人們的廣泛關注。由于BMSCs無特異性的表面抗原表型，因此對BMSCs進行分離、提純、鑒定存在一定的難度。目前，主要有全骨髓貼壁培養法、流式細胞儀分選法、密度梯度離心法和免疫磁珠分選法獲得BMSCs。盡管目前有很多種方法能從骨髓中分離獲取BMSCs，但是仍沒有一個最佳的培養方案[7-9]。本研究嘗試全骨髓貼壁培養法體外培養SD大鼠骨髓基質干細胞，觀察其生物學特性，鑒定細胞表型，并定向誘導其分化成骨、成脂，以期獲得一種生長狀態良好，純度高，生物學性狀穩定的大鼠骨髓基質干細胞。

1 材料與方法

1.1 材料

4齡SD大鼠10只（SPF級），雌雄不限。體重約120 g/只。購于廣西醫科大學動物實驗中心。合格證號：SCXK（桂）2009-0002。DMEM-LG培養基，新生胎牛血清（美國Hyclone公司）。0.25% EDTA-胰酶（上海生工生物工程技術有限公司）。噻唑藍（MTT）青-鏈霉素（雙抗），二甲基亞砜（DMSO）（北京賽萊博科技發展有限公司）。Anti-Mouse/Rat CD29 （Integrin beta 1） FITC，Anti-Rat CD45 PE，Anti-rat CD90 FITC，Armenian Hamster IgG Isotype Control FITC，Mouse IgG1 K Isotype Control PE（ebioscience公司）。成骨誘導分化培養基，成脂誘導分化培養基，茜素紅溶液，油紅O溶液（cyagen公司）。

1.2 方法

1.2.1 研究時間 2012年9月～2013年4月。

1.2.2 實驗細胞取材 處死大鼠后，放入75%酒精浸泡約10 min，無菌條件下取出股骨和脛骨，PBS沖洗后，剪開兩側骨端，DMEM低糖培養液沖洗骨髓腔，收集細胞懸液，并置入70 mm細胞培養皿內，加入適量完全培養基，放置于 37℃、5% CO2恒溫培養箱內培養。

1.2.3 大鼠BMSCs培養及傳代 上述骨髓細胞懸液培養3 d后首次換液，以后每2天換液一次，以去除未貼壁細胞。當貼壁細胞達80%～90%融合時，去除培養液，胰蛋白酶消化。1000 rpm/min離心5 min，按照1∶2比例傳代，每2天換液一次，直至細胞融合至80%～90%，再進行消化傳代。

1.2.4 大鼠BMSCs細胞形態觀察 倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，鏡檢拍照。

1.2.5 大鼠BMSCs生長曲線繪制（MTT法） 以1×104/cm2接種處于對數生長期的P7代BMSCs于96孔板。每孔加入200 μL完全培養液置于37℃、5% CO2孵箱中培養，隔天換液1次。從種板第2天起每天取一板，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，37℃、5% CO2孵箱中培養4 h后終止培養。棄除孔中培養液。每孔加入150 μL DMSO溶液，置于搖床上緩慢搖勻10 min，使結晶物充分溶解。酶標儀測定，選擇490 nm波長，測各孔吸光度值。以時間為橫坐標，吸光度均值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.6 大鼠BMSCs流式細胞儀細胞表型鑒定 胰蛋白酶消化P7代大鼠BMSCs，PBS液終止消化，短時低速離心2～3次，以去除細胞懸液中的細胞碎片。計數細胞：以106個/管的細胞數分別加入A、B、C、D、E共5個EP管。A管加入2 μL CD29-FITC，B管加入1.25 μL CD45-PE，C管加入1.25 μL CD90-PE，D管加入2 μL CD29同型-FITC，E管加入1.25 μL同型-PE。4℃冰箱避光孵育30 min。PBS液洗滌1～3次，以200 μL PBS液重懸細胞后，細胞篩過濾，移入上樣管，流式細胞儀檢測表面標記CD29、CD45、CD90表達情況。

1.2.7 成骨誘導 選擇P5代SD大鼠BMSCs，待細胞達到80%～90%融合時，消化。將干細胞接種于干燥的明膠溶液六孔板中，每孔約3×103個細胞，加入2 mL/孔干細胞完全培養液。放入37°C，5% CO2孵箱中培養24 h后，移除培養液，加入2 mL/孔成骨誘導液。每3天換液，誘導3周后進行茜素紅染色。對照組加入等量完全培養基，相同條件下培養進行茜素紅染色。倒置相差顯微鏡下觀察兩組結果并拍照。

1.2.8 大鼠BMSCs成脂誘導 選擇P5代SD大鼠BMSCs，0.25%胰酶消化接種于六孔板中，每孔約2.0×104個，加入2 mL完全培養液置于37°C，5%CO2孵箱中培養。每3天更換細胞完全培養液，直至細胞生長達到100%融合。移除培養液，每孔加入2 mL成脂誘導液A，3 d后更換成成脂誘導液B進行維持培養，24 h后更換成成脂誘導液A再次誘導，重復3～5個循環。當脂滴出現較多，但形態較小時，改用成脂誘導液B進行維持7 d，脂滴增大時，行油紅O染色。對照組加入等量的完全培養基，相同條件下培養進行油紅O染色。倒置相差顯微鏡下觀察兩組結果并拍照。

2 結果

2.1 大鼠BMSCs生長及形態觀察

經體外培養的大鼠P0代BMSCs 24 h后部分細胞開始貼壁，48～72 h貼壁細胞在皿底伸展開，呈短梭形；1～2 d后細胞形態呈多邊形，細胞呈集落狀生長。P0代細胞增殖速度較慢，約5～7 d后細胞集落匯合達80%以上，并快速開始增值，細胞形態以梭形為主，較一致。倒置相差顯微鏡下觀察可見細胞成簇生長，類似魚群狀、菊花瓣狀或漩渦狀。全骨髓貼壁培養法培養的SD大鼠BMSCs能穩定增殖10代以上。P1～P5代BMSCs增殖速度較快，細胞生長狀態好，形態穩定。其后逐漸減慢，P10代之后細胞形態明顯老化，細胞包體變大，邊緣粗糙，形狀不規則。見封三圖9。

2.2 MTT法繪制大鼠BMSCs生長曲線

SD大鼠BMSCs在接種于6孔板后1～ 2 d，細胞生長曲線低平，吸光值變化不大，為細胞潛伏適應期。隨后的第3～8天見細胞生長曲線呈“J”型，說明該時間段細胞處于對數生長期。第8天后細胞增殖減慢明顯，曲線變得平緩，進入平臺期。見圖1。

2.3 大鼠BMSCs流式細胞儀進行細胞CD29、CD45、CD90表型鑒定結果

本實驗取CD29、CD45、CD90及其同型抗體，流式細胞儀進行細胞表型鑒定，結果表明，全骨髓貼壁培養法培養的第7代SD大鼠BMSCs表達CD29，CD90，陽性率為90.4%，81.2%；而不表達CD45，陽性率為0.6%。同型-FITC表達率為0.4%，同型-PE表達率為0.4%，說明本實驗培養的細胞符合大鼠BMSCs的表型特征。見圖2。

2.4 大鼠BMSCs成骨誘導結果

將成骨誘導液培養誘導21 d的SD大鼠BMSCs和普通完全培養液培養誘導21 d的SD大鼠BMSCs同時行茜素紅染色后，放置于倒置相差顯微鏡下觀察。倒置相差顯微鏡下可見誘導培養組出現明顯染色的鈣結節，而對照組未見鈣結節。說明本實驗誘導培養的SD大鼠BMSCs具有成骨能力。見封三圖10。

2.5 大鼠BMSCs成脂誘導結果

將成脂誘導液誘導培養5個周期的SD大鼠BMSCs和普通完全培養液誘導培養的SD大鼠BMSCs同時進行油紅O染色后，放置于倒置相差顯微鏡下觀察結果。倒置相差顯微鏡下可見誘導培養組出現染色明顯的脂滴，而對照組未見明顯的脂滴。說明本實驗誘導培養的SD大鼠BMSCs具有成脂能力。見封三圖11。

3 討論

3.1 BMSCs的體外分離與培養

全骨髓貼壁培養法是應用最早的純化、分離BMSCs的方法。由Luria 等[10]首先發現BMSCs貼壁生長的特性，并發明了這種純化、分離BMSCs的培養方法。全骨髓貼壁培養法根據BMSCs在培養皿中貼壁生長，而造血系細胞在培養皿中懸浮生長的特性區別，通過定期更換培養液，去除懸浮細胞和細胞碎片，收集貼壁生長的BMSCs的方法。

該培養法所抽取的骨髓不經過過濾也不離心，骨髓中豐富的生長因子得以保存，這些生長因子能促進BMSCs的增殖。其操作簡單，既降低了離心對細胞的損害，又減少了污染機會，節省實驗費用，且分離的BMSCs貼壁時間短，增殖周期短，細胞數量較多，經多次傳代后能夠逐步純化，是獲取分離BMSCs的成本低廉的簡單有效方法[11-13]。

本實驗應用全骨髓貼壁培養法純化和分離SD大鼠骨髓基質干細胞，經體外培養的大鼠P0代BMSCs 24～48 h左右部分細胞開始貼壁，48～72 h貼壁細胞在皿底伸展開，呈短梭形；1～2 d后細胞呈集落狀生長，部分細胞呈多邊形，細胞形態主要為成纖維樣細胞。傳代細胞12 h左右能穩定貼壁，并快速開始增值，細胞形態以梭形為主，較一致，倒置相差顯微鏡下觀察可見細胞成簇生長，類似魚群狀、菊花瓣狀或漩渦狀。約2～5 d長滿瓶底。全骨髓貼壁培養法培養的SD大鼠BMSCs能穩定增殖10代以上。細胞增殖速度快，細胞生長狀態良好，細胞形態均一穩定。SD大鼠BMSCs在接種于6孔板后1～2 d為細胞潛伏適應期，隨后的第3～8天見細胞生長曲線呈“J”型，說明該時間段細胞處于對數生長期。第8天后細胞增殖減慢明顯，曲線變得平緩，進入平臺期。從細胞增殖傳代能力和形態學上觀察該法可獲得生長狀態良好，高純度的SD大鼠BMSCs。

3.2 BMSCs的表型鑒定

迄今為止BMSCs表面抗原具有非專一性，BMSCs表面未發現特異性抗原表型。BMSCs表達CD105、CD73、CD90、CD29等。BMSCs不表達HLA-DR，即主要組織相容性復合物分子，不表達HLA-Ⅱ抗原、MHC-Ⅱ分子、B7-1、B7-2、CD11a、CD40和Fas L，不表達或極低水平表達HLA-Ⅰ抗原、MHC-Ⅰ分子。BMSCs也不表達造血細胞表面陽性標志，例如CD14、CD34、CD45等[14]，BMSCs具有低免疫原性、誘導免疫耐受和免疫抑制的作用。目前，對BMSCs的研究仍處于探索階段，還沒有理想的、用于鑒定的標志性分子或方法[15-17]。2006年，國際細胞治療協會確定BMSCs的鑒定標準為：①從骨髓中提取，在塑料培養皿內貼壁生長，在含血清的培養基內高度增殖。②表達CD105、CD73、CD90，不表達CD34、CD45、CD14或CD11b、CD79a或CD19；③在體外可以分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等。并非某個或某幾個表面標記符合干細胞的特性就能證明該細胞是BMSCs。一般是通過BMSCs的細胞形態、表型及功能來綜合鑒定。

本實驗取CD29、CD45、CD90及其同型抗體，用流式細胞儀進行細胞表型鑒定，結果顯示，該法培養的P7代SD大鼠BMSCs表達CD29，CD90，陽性率分別為90.4%，81.2%；而不表達CD45，陽性率為0.6%。同型-FITC表達率為0.4%，同型-PE表達率為0.4%，說明本實驗誘導培養的細胞符合大鼠BMSCs的表型特征。

3.3 BMSCs的多向分化潛能鑒定

BMSCs具有很強的多向分化以及自我更新潛能，且經多次傳代后，這些細胞還能保持多向分化潛能。最近的研究表明BMSCs可在體內、體外誘導分化成為各族中胚層組織來源的細胞[18-22]。

本實驗將成骨誘導液培養誘導的SD大鼠BMSCs行茜素紅染色后，放置于倒置相差顯微鏡下觀察結果，倒置相差顯微鏡下可見染色明顯的鈣結節，而對照組未見鈣結節。說明本實驗培養誘導的SD大鼠BMSCs具有成骨能力。將成脂誘導液培養誘導的SD大鼠BMSCs行油紅O染色后，放置于倒置相差顯微鏡下觀察結果。倒置相差顯微鏡下可見明顯染色的脂滴，而對照組未見明顯的脂滴。說明本實驗培養的SD大鼠BMSCs具有成脂能力。

綜上所述，全骨髓貼壁培養法培養出的BMSCs為生長狀態良好，純度高，且分化及增殖能力強的BMSCs。

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（收稿日期：2015-08-27）