睫狀神經營養因子對糖尿病大鼠海馬膽堿乙酰轉移酶表達及認知功能的影響

睫狀神經營養因子對糖尿病大鼠海馬膽堿乙酰轉移酶表達及認知功能的影響

黃薇楊巧劉霞張莉夏麗肖謙

(重慶醫科大學附屬第一醫院老年科，重慶400016)

摘要〔〕目的探討睫狀神經營養因子(CNTF)對糖尿病(DM)大鼠海馬膽堿乙酰轉移酶(ChAT)表達及認知功能的影響及機制。方法50只SD大鼠隨機分為正常對照組、DM組、DM+DMSO組、DM+CNTF組和DM+CNTF+AG490組，每組10只。腹腔注射建立鏈脲佐菌素(STZ)DM大鼠模型，Open-field實驗排除抑郁DM大鼠，Morris水迷宮測試大鼠逃避潛伏期和穿越目標區域次數，Western印跡以及免疫組化檢測大鼠海馬ChAT蛋白水平，RT-PCR檢測ChAT mRNA水平。結果與正常對照組相比，DM組、DM+DMSO組及DM+CNTF+AG490組逃避潛伏期延長(P<0.05),穿越目標區域次數減少(P<0.05)，海馬部位ChAT mRNA和蛋白的表達水平顯著下降(P<0.05)；與DM組相比，DM組+CNTF組大鼠逃避潛伏期時間及穿越目標區域次數的成績明顯改善(P<0.05),海馬部位ChAT mRNA和蛋白的表達水平明顯升高(P<0.05)。結論CNTF對DM大鼠認知功能有改善作用，其機制可能與通過JAK2/STAT3途徑上調ChAT mRNA和蛋白表達水平有關。

關鍵詞〔〕睫狀神經營養因子；糖尿病腦病；膽堿乙酰轉移酶；認知功能

中圖分類號〔〕R587.1〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金(81170752)；重慶市自然科學基金CSTC(2010BB5396)；重慶市衛生局科研項目(重點)(2010-1-8)

通訊作者：肖謙(1956-)，男，主任醫師，教授，博士生導師，主要從事老年內分泌代謝研究。

第一作者：黃薇(1984-)，女，在讀碩士，醫師，主要從事老年內分泌代謝研究。

Effects of ciliary neurotrophic factor on the expression of choline acetyltransferase in hippocampus and the cognitive function of diabetic rats

HUANG Wei，YANG Qiao, LIU Xia,etal.

Department of Geriatrics,the First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of ciliary neurotrophic factor(CNTF) on the expression of choline acetyltransferase (ChAT) in hippocampus and cognitive function of diabetic mellitus(DM), and explore its possible mechanism.Methods50 SD male rats were meanly divided into normal, DM, DM+DMSO, DM+CNTF, DM+CNTF+AG490 groups randomly. Streptozotocin-diabetic rats model were established, diabetic rats with depression were screened by open-field test. Escape latency and frequency of entrance into the target zone were measured by Morris water maze. The mRNA and protein levels of ChAT were examined with RT-PCR，Western blot and immunohistochemistry.ResultsCompared to that of normal group，escape latency was increased and frequency of entrance into the target zone was decreased significantly in DM,DM+DMSO and DM+CNTF+AG490 groups(P<0.05),the mRNA and protein levels of ChAT in hippocampal were decreased significantly(P<0.05) .The scores of escape latency and frequency of entrance into the target zone were highly improved in DM+CNTF group，the mRNA and protein expressions of ChAT in hippocampal were increased markedly than those of DM group(P<0.05) .ConclusionsCNTF could improve cognitive ability of DM rats by increasing the mRNA and protein expressions of ChAT through the JAK2/STAT3 pathway.

【Key words】Ciliary neurotrophic factor; Diabetic encephalopathy; Choline acetyltransferase；Cognition

睫狀神經營養因子(CNTF)與神經系統發育、功能維持和損傷修復有密切的關系，是一種能夠促進多種神經細胞存活，在神經系統發育、分化和損傷修復中具有重要作用的神經營養因子。CNTF對阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、糖尿病視網膜病變及周圍神經病變等均有改善作用，但對糖尿病認知功能障礙發病過程有無影響至今未見報道。本研究擬觀察 CNTF對糖尿病(DM)大鼠海馬膽堿乙酰轉移酶(ChAT)表達水平及認知功能的影響，探討DM認知功能障礙可能的發病機制。

1材料與方法

1．1材料鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司)；血糖儀(德國拜耳公司)；大鼠腦立體定位儀(美國Stoelting公司)；Morris水迷宮及水迷宮記錄分析系統 (中國淮北正華生物儀器設備有限公司研制)；CNTF(美國PeproTech公司)；兔抗大鼠ChAT多克隆抗體(abcam公司)；AG490(美國Sigma公司)；RNA總抽提試劑，逆轉錄試劑盒，DNA marker DL500(TaKaRa公司)；引物合成:上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2方法

1．2．1動物分組與處理SPF級Spraque-Dawley(SD)雄性大鼠50只,8～10周齡,體重180～220 g,購自重慶醫科大學動物實驗中心。動物適應喂養1 w后,隨機分為正常對照組(C組)、DM組、DM+二甲基亞砜(DMSO)組、DM+CNTF組和DM+CNTF+AG490組，每組10只，注射STZ建立DM模型。成模后第11周,各組均進行礦場(Open-field)實驗,排除抑郁DM大鼠。隨后進行Morris水迷宮測試,測試結束后給予各組大鼠側腦室注射，持續注射1 w后,所有實驗大鼠再次進行水迷宮測試。實驗終點DM+CNTF+AG490組大鼠死亡1只。

1．2．2Open-field實驗以穿越底面的格數及后肢站立次數記錄水平運動次數和垂直運動次數，了解大鼠的活動度及其對新鮮環境的好奇程度,并計數修飾次數。

1．2．3Morris水迷宮測試DM模型建模成功后第11周,訓練3 d,第4天進行隱藏平臺獲得實驗,分析潛伏期,測試學習能力。第5天撤去平臺進行空間搜索實驗，去除平臺觀察2 min內大鼠通過原平臺的次數,測試記憶能力。CNTF及AG490干預1 w后重復上述實驗。

1．2．4CNTF干預成模后第11周,各組大鼠水迷宮測試完畢即予CNTF及AG490干預。大鼠經4%水合氯醛(10 ml/kg)腹腔注射麻醉后,固定于腦立體定位儀上,沿顱頂正中線剪開頭皮暴露顱骨,大鼠側腦室穿刺坐標〔1,2〕:前囟后1.0 mm,右1.5 mm,深3.5 mm。微型電鉆沿此穿刺點鉆孔。將帶內芯的不銹鋼套管(外徑0.86 mm,內徑 0.5 mm)垂直插入側腦室內,牙托粉黏合固定套管,凝固后縫合傷口。術后大鼠予以青霉素抗炎并分籠飼養。導管置入后第4天進行側腦室注射。①正常對照組和DM組注射等量生理鹽水；②DM+DMSO組注射等量2.99%DMSO(<3%)；③DM+CNTF組：微量注射器3 min內將CNTF(0.5 nmol/L,2 μl)〔3〕緩慢勻速注入側腦室，留針約1 min；④DM+CNTF+AG490組：微量注射器3 min內將CNTF(0.5 nmol/L,2 μl)和AG490(29 nmol/L,2 μl)〔4〕緩慢勻速注入側腦室，留針約1 min；各組大鼠每天給藥1次，連續7 d。

1．2．5RT-PCR法大鼠斷頭,低溫下快速取出海馬組織,液氮凍存。按RNA提取試劑說明書提取海馬的總RNA。ChAT上游引物序列5'CCAGTTCTTTGTCTTGGATGTT3′，下游引物序列5'GGACGCCATTTTGACTATCTTT3′，擴增長度為94 bp；β-actin上游引物序列5'CACCCGCGAGTACAACCTTC3′，下游引物序列5'CCCATACCCACCATCACACC3′，擴增長度為207 bp。反應體系：cDNA 2 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，pre-Taq PCR 12 μl，ddH2O 9 μl。 ChAT反應條件:94℃預變性2 min;94℃ 30 s，56.3℃退火40 s，72℃延伸30 s,40個循環;72℃再延伸10 min;4℃保存。β-actin反應條件：94℃預變性 2 min;94℃ 30 s，57.8℃退火40 s，72℃延伸30 s,35個循環;72℃再延伸10 min;4℃保存。取上述PCR產物5 μl用2% 瓊脂糖進行凝膠電泳。凝膠成像分析系統掃描 RT-PCR電泳結果,Quantity One軟件測定Volumn值,計算ChAT /β-actin比值。

1．2．6Western 印跡稱取-80℃冰箱保存的海馬組織100 mg，加入0.2 ml RIPA和2 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)，超聲細胞破碎儀低溫勻漿，離心后二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，蛋白質轉膜，免疫印跡，電化學發光法(ECL)顯影后條帶經凝膠成像軟件分析，以ChAT/β-actin條帶灰度比值表示ChAT蛋白的相對表達水平。

1．2．7免疫組化采用鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)法。處死大鼠,1%多聚甲醛心臟灌注取腦,石蠟包埋連續冠狀切片,根據試劑盒說明檢測 ChAT在各組大鼠海馬的表達。

2結果

2．1Morris水迷宮測試結果DM組、DM+DMSO組及DM+CNTF+AG490組逃避潛伏期增加,與正常對照組比較差異顯著(P<0.05)。DM+CNTF組較DM組逃避潛伏期明顯縮短，通過原平臺位置次數明顯增加(P<0.05),與正常對照組比較無明顯差異(P>0.05)。見表1。

2．2ChAT mRNA及蛋白的表達與正常對照組比較，DM 組、DM+DMSO組及DM+CNTF+AG490組 ChAT mRNA及蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)；與 DM 組、DM+DMSO組及DM+CNTF+AG490組比較，DM +CNTF組ChAT mRNA及蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。見圖1，圖2，表2。

2．3免疫組化結果與正常對照組相比，DM組、DM+DMSO組及DM+CNTF+AG490組海馬 ChAT陽性神經元明顯降低；DM+CNTF組與DM組、DM+DMSO組及DM+CNTF+AG490組比較,上述指標明顯增加,但仍少于正常對照組。見圖3，表2。

表1　大鼠空間搜索實驗及隱蔽平臺搜索實驗結果 ± s)

與正常對照組比較：1)P<0.05,；與DM組比較：2)P<0.05;與DM+CNTF組比較：3)P<0.05；下表同

M:Markers;A:正常對照組；B:DM組；C:DM+DMSO組；D:DM+CNTF組；E:DM+CNTF+AG490組；下圖同 圖1　各組大鼠海馬區ChAT mRNA的表達

圖2　Western印跡檢測各組大鼠海馬ChAT蛋白表達

組別nChAT/β-actin(mRNA)ChAT/β-actin(蛋白)ChAT平均光密度正常對照組100.74±0.050.29±0.030.24±0.01DM組100.27±0.021)3)0.17±0.021)3)0.17±0.021)DM+DMSO組100.27±0.021)3)0.17±0.011)3)0.18±0.021)DM+CNTF組100.51±0.031)0.26±0.011)0.23±0.011)DM+CNTF+AG490組90.26±0.021)3)0.17±0.021)3)0.17±0.021)3)

圖3　各組大鼠海馬區ChAT免疫組化染色結果(×400)

3討論

CNTF因最初從雞的睫狀神經節中提取出來而得名，屬神經營養因子家族成員，是目前公認的影響大腦認知功能的一種內源性調節因子，主要分布在成人大腦的海馬顆粒下層。細胞培養顯示，CNTF對基底前腦膽堿能等多種神經元有營養作用，并通過激活Janus蛋白酪氨酸激酶2/信號轉導和轉錄激活子3(JAK2/STAT3)途徑發揮作用。乙酰膽堿是影響認知功能的一種重要神經遞質，ChAT作為膽堿能神經遞質合成過程中最關鍵的酶，直接決定生物體內乙酰膽堿的含量，是調節認知功能的重要蛋白質。前期研究證實，糖尿病認知功能障礙早期基底前腦、海馬等處膽堿能神經元存在明顯退行性改變，ChAT表達減少〔5〕，提示ChAT的差異性表達參與了DM認知功能障礙的發生、發展過程。

本研究通過建立DM大鼠模型，發現成模后DM大鼠學習記憶能力下降,認知功能已經受損，ChAT可能參與此過程；側腦室注射外源性CNTF后，DM大鼠學習和記憶能力明顯改善，可能與上調海馬區ChAT表達水平有關；本實驗還發現，當CNTF作用被JAK2拮抗劑AG490阻斷后,大鼠水迷宮測試潛伏期延長,穿越目標區域次數減少,但海馬區ChAT mRNA和蛋白表達量仍較對照組顯著降低，提示CNTF上調海馬區ChAT mRNA和蛋白表達，改善DM大鼠認知功能障礙的效應部分是通過JAK2/STAT3信號途徑實現的。除此以外，CNTF改善DM大鼠認知功能的作用還可能存在其他機制。CNTF能緩解腦缺血造成的空間認知障礙，組織學研究顯示皮質的梗死灶和同側丘腦神經元逆行性變形均有改善；CNTF對感覺神經元、運動神經元、海馬膽堿能神經元及黑質多巴胺能神經元等均有促進存活及防止損傷的作用。

綜上所述，我們有理由推測CNTF至少部分通過JAK2/STAT3途徑〔6~9〕，改善神經元退行性變化，上調海馬區ChAT表達水平，促進膽堿能神經遞質的合成，這可能是其改善DM認知功能障礙的又一重要途徑。

4參考文獻

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〔2013-12-17修回〕

(編輯袁左鳴/徐杰)