灰樹花多糖聯合順鉑誘導HeLa細胞凋亡

灰樹花多糖聯合順鉑誘導HeLa細胞凋亡

呂冬霞羅文哲劉娜1范曉艷魏鳳香2

(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江佳木斯154007)

摘要〔〕目的探討灰樹花多糖(PGF)聯合順鉑(DDP)誘導HeLa細胞凋亡及其可能的分子機制。方法四甲基偶氮唑藍比危法(MTT)檢測細胞增殖抑制率，RT-PCR法檢測survivin和caspase-3 mRNA的表達。結果MTT法顯示，聯合用藥抑制率均高于單藥組(P<0.05)。PGF 0.05 mg/L與DDP 1 mg/L聯合作用24 h時，Q>1.15； RT-PCR顯示，聯合用藥組與兩單藥組比較 survivin mRNA 表達下調，caspase-3 mRNA 表達上調。結論聯合用藥對HeLa細胞的抑制率較單獨用藥組有明顯提高。聯合用藥24 h時點，二者有協同作用。聯合用藥誘導HeLa細胞凋亡可能與凋亡基因survivin表達下調和caspase-3基因表達上調有關。

關鍵詞〔〕灰樹花多糖；順鉑；細胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

中圖分類號〔〕R730.52〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：黑龍江省衛生廳研究項目(No.2009-343)

通訊作者：魏鳳香(1974-)，女，副教授，碩士生導師，主要從事腫瘤發生機制與生物學治療研究。

1白城實驗中學2深圳龍崗區婦幼保健院

第一作者：呂冬霞(1965-)，女，教授，碩士生導師，主要從事腫瘤發生機制與生物學治療研究。

灰樹花多糖(PGF)具有改善免疫系統功能、抑制腫瘤、調節血糖等功能〔1〕。順鉑(DDP)廣泛應用于多種實體瘤的治療中且療效確切。本研究探討PGF聯合DDP對HeLa細胞敏感作用及其可能的機制，為臨床治療宮頸癌提供新思路。

1材料與方法

1.1材料人宮頸癌HeLa細胞購于武漢大學典型培養物冷藏中心。其他主要儀器及試劑有：凈化工作臺(蘇州凈化設備廠)、二氧化碳培養箱(SHEL LAB2300，美國)、倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)、酶標儀(LABSYSTEMS)、PCR儀( PE-5700，美國)、電泳儀(北京六一儀器廠)、電泳槽(北京東方儀器)、流氏細胞儀(美國BD公司)；小牛血清與RPMI-1640培養液(杭州四季青)，二甲基亞砜 (DMSO，Amersco)、MTT(上海普飛生物技術有限公司)、灰樹花多糖粉末(浙江方格藥業有限公司)、順鉑粉劑(山東齊魯制藥廠)、總RNA提取與RT-PCR試劑盒(大連寶生物)，細胞凋亡試劑盒(南京凱基公司)。

1.2細胞培養使用含10%滅活小牛血清的RPMI-1640完全培養液培養細胞。常規方法傳代。

1.3四甲基偶氮唑藍比色法(MTT)檢測細胞增殖抑制率及評價聯合用藥效果取對數生長期HeLa細胞移入96孔培養板中，細胞密度1×104個/ml，每孔加入200 μl細胞懸液，37℃、5%CO2的培養箱中培養。24 h后，棄去原培養液，分別加入不同濃度的PGF或DDP的RPMI1640培養液200 μl。PGF組中，加入不同濃度的多糖溶液，其終濃度分別為0.01、0.05、0.1 mg/L；DDP組中，加入不同濃度的順鉑溶液，其終濃度分別為0.25、0.5、1 mg/L；聯合用藥組中，取PGF溶液為0.05 mg/L，分別與DDP0.25、0.5、1 mg/L聯合；空白對照組中僅加10%小牛血清的RPMI1640培養液。每個濃度設立8個復孔，把培養板移入培養箱中培養，經過12、24、48 h 后分別加入MTT(5 mg/L)20 μl，繼續培養4 h，吸棄孔內培養上清液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。選擇490 nm波長酶聯免疫儀檢測，以空白孔調零，測定各孔吸光度值(OD)。細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%；評價聯合用藥效果：q值=E(A+B)/EA+EB(1-EA)〔EA、EB、E(A+B)分別為PGF組、DDP組及聯合組的抑制率〕。根據q值評價聯合用藥效果，若q<0.85 為拮抗，0.85~1.15為相加，q>1.15為協同。根據試驗結果，找到一組有協同或相加作用的組合，以下試驗均采用這一濃度藥物。

1.4半定量RT-PCR檢測survivin、caspase-3基因mRNA表達選取空白對照組、PGF 0.05 mg/L、DDP 1 mg/L、聯合用藥組為0.05 mg/L PGF和1 mg/L DDP、只加含10%小牛血清的RPMI1640培養液。藥物作用24 h后，先提取細胞總RNA，再進行反轉錄反應，最后將逆轉錄產物cDNA進行PCR反應。引物設計參照文獻〔2〕，PCR反應引物為survivin：正義5′-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CT-3，反義5′-GGC TCT TTC TCT GTC CAG TTT CA-3′；caspase-3：正義5′-GCT ATT GTG AGG CGG TTG T-3′，反義5′-CGT TTG GAG TCC CTT TGT-3′；β-actin：正義5′-ACA CTG TGC CCA TCT ACG AGG-3′，反義5′-AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT-3′。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析系統觀察結果、拍照并分析。以β-actin的表達量為對照，計算并比較各組caspase-3及survivin的相對表達量。

1.5統計學方法采用SPSS11.5軟件行t檢驗。

2結果

2.1MTT法檢測細胞增殖抑制率及評價聯合用藥效果PGF對HeLa細胞的增殖抑制作用均有明顯的劑量-效應和時間-效應依賴關系。DDP對HeLa細胞的增殖抑制作用均有明顯的劑量-效應和時間-效應依賴關系。

根據上述實驗結果，選取0.05 mg/L PGF分別與0.25、0.5、1 mg/L的DDP聯合作用于HeLa細胞(其他組合有待后續研究中進行)，對照組加等量的培養基。 MTT比色法分析結果顯示細胞增殖被抑制。PGF與DDP聯合作用24 h時，抑制率均高于單藥組(P<0.05)，其中0.05 mg/L PGF與1 mg/L DDP聯合作用于24 h時的q值為1.17，表現出協同作用，其余均為相加作用。

2.2RT-PCR檢測survivin、caspase-3基因mRNA表達與空白對照組比較，PGF組survivin表達降低，caspase-3 mRNA表達上調(P<0.05)。兩藥聯合組caspase-3 mRNA的表達高于兩單藥組(P<0.05)，survivin mRNA的表達低于兩單藥組(P<0.01)，見表1。

組別caspase-3/β-actinsurvivin/β-actin空白對照組0.816±0.0874)0.931±0.0324)順鉑組1.117±0.0252)3)0.716±0.0372)4)PGF1.016±0.0761)3)0.826±0.0471)4)聯合組1.214±0.0532)0.550±0.0492)

與空白對照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01;與聯合組比較:3)P<0.05，4)P<0.01

3討論

本實驗結果提示PGF對DDP可能起到增敏作用。誘導細胞凋亡的因素很多，凋亡抑制蛋白(IAP)是一種廣泛表達的抑制凋亡的基因家族〔3，4〕，在功能上具有抑制細胞凋亡的作用。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，在絕大多數腫瘤組織中表達。Caspase是細胞凋亡的核心執行者〔5，6〕。Caspase-3屬于效應Caspase〔7〕。本實驗提示PGF和DDP激活細胞凋亡具有共同的途徑，這可能是它們在一定的劑量時產生協同作用使PGF對DDP具有增敏作用。

4參考文獻

1Mayell M.Maitake extracts and their therapeutic potential〔J〕.Altern Med Rev，2001；6(1)：48-60.

2韋星，涂碩，萬福生，等.白英乙醇提取物誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡及其對凋亡相關基因表達的影響〔J〕.四川中醫，2007；25(9)13-5.

3曹世龍.腫瘤學新理論與新技術〔M〕.上海：上海科技教育出版社，1997：463.

4Hejna M，Raderer M，Zielinski CC.Inhibition of metastases by anticoagulants〔J〕.J Natl Cancer Inst，1999；91(1)：22-36.

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6Rao RV，Hermel E.Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program.mechanism of caspase activation.〔J〕J Biol Chem，2001；276(36)：33869-74.

7Nicholson DW，Ali A，Thornberry NA，etal.Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease nessary for mammalian apoptosis〔J〕.Nature，1995；376(1)：37-43.

〔2014-10-02修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)