內質網應激參與動脈粥樣硬化機制的研究進展

周昌鉆+季政++孟立平++郭航遠

[關鍵詞] 內質網應激；動脈粥樣硬化；細胞凋亡；細胞自噬；炎癥反應

中圖分類號：R543.3；R363.2 文獻標識碼：A 文章編號：1009-816X（2015）06-0482-04

doi.10.3969/j.issn.1009-816x.2015.06.16

內質網是一種存在于真核細胞中并與核膜、高爾基體、細胞膜相互連續，參與分泌蛋白、膜蛋白折疊及Ca2+水平調節的復雜膜性結構。內質網發揮折疊功能需分子伴侶參與，如葡萄糖調節蛋白78kDa （glucoseregulated protein 78kDa，GRP78）、鈣連蛋白、鈣網蛋白幫助新生多肽正確折疊，糖基化修飾酶類（寡糖轉移酶、葡糖苷酶、甘露糖苷酶）進行糖化修飾。此外，內質網腔內氧化還原狀態和高鈣環境也是其發揮功能所必須的。內質網對內外環境變化敏感，可受高糖、缺氧、藥物、血流剪切力等因素干擾，影響其蛋白質折疊功能，即內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。ERS主要激活三條信號通路：未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR），內質網超負荷反應和固醇調節級聯反應。目前對ERS信號通路的研究主要集中在UPR信號通路。

研究顯示ERS參與了心血管疾病、腫瘤、神經退行性疾病、腎臟疾病、肝臟疾病等的發生與發展。ERS作為一種重要機制參與多種疾病的調節，但其具體作用方式仍不明確。本文重點就內質網應激參與動脈粥樣硬化這一病理生理過程的調節機制做一論述。

1 ERS

ERS刺激細胞產生保護性的UPR反應。由輕微的、短暫的環境變化引起的ERS可被UPR反應迅速糾正，避免機體的損傷。而明顯的病理環境下引起的ERS常持續而強烈，超過UPR的糾正能力，進一步激活UPR下游的損傷性信號通路，導致細胞損傷甚至最終誘導細胞死亡。UPR信號通路包括蛋白激酶樣內質網激酶（PKR-like ER kinase，PERK）信號通路、肌醇需求酶1 （inositol-requiting enzyme 1，IREl）信號通路、活化轉錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）信號通路。三種ERS感受器同屬于內質網膜蛋白，一般情況下與GRP78結合并處于無活性狀態。內質網未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內質網控的積聚可誘導GRP78與三者解離，并促使三種膜蛋白磷酸化激活，啟動下游信號通路。信號通路從促進蛋白質折疊、抑制蛋白質翻譯、降解錯誤折疊蛋白質三方面減輕內質網負荷。研究發現，其他改變應激感受器分子構象的因素，如內質網腔ATP、Ca2+及氧化還原水平的改變或者應激感受協同因子Erdj5，都可通過影響其與GRP78的連接，誘發ERS。

1.1 PERK-CHOP信號通路：PERK腔內端與GRP78解離后暴露磷酸化位點并被激活。激活的PERK受體可磷酸化真核細胞翻譯起始因子2（eukaryotic trans-lation initiation factor 2，eIF2）a亞基，抑制其征集Met-tRNA和40S核糖體亞單位的能力，最終影響大多數蛋白質的翻譯。但是，UPR信號通路中的多種信號通路蛋白，如ATF4卻可逃避這種機制的影響，在細胞內繼續翻譯表達。ATF4可作為轉錄因子進入細胞核，結合于UPR相關基因啟動子的ERS反應元件（ER stress response element，ERSE），上調CAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CAAT/enhancer-binding protein ho-mologous protein， CHOP）及生長抑制與DNA損傷誘導基因34 （growth arrest and DNA-damage-inducible gene34，GADD34）的表達。GADD34可去磷酸化eIF2a-P，恢復eIF2a正確活性，防止蛋白表達抑制過度導致的細胞死亡。CHOP與其同源蛋白結成穩定的二聚體，作為轉錄因子調節目的基因表達，一方面抑制抑凋亡基因Bcl-2、Bnip3表達，另一方面使凋亡基因，如GADD34、Bim上調，最終導致細胞凋亡。CHOP除受PERK調節外，也受到IRE1和ATF6信號通路的調節，但不作為主要調節機制。

1.2 IREl-XBP1信號通路：IRE1與GRP78解離后，在空間上相互接近并發生自體磷酸化。P-IREla具有核酸內切酶活性，從X盒結合蛋白1（X-box binding protein-l，XBP-1） mRNA中特異性剪切出26個堿基的內含子，改變XBP-1 mRNA開放閱讀框，最終翻譯出有活性的XBP1蛋白。XBP1蛋白進入細胞核，結合于ERSE，既可上調ERS相關降解（endoplasmic reticu-lum-associated degradation，ERAD）的相關蛋白如GRP78的表達，也可影響脂質代謝進程。此外，研究發現IRE1可根據mRNA編碼序列，選擇性降解引起ERS蛋白的mRNA，在翻譯水平減少蛋白質產生，緩解ERS。

1.3 ATF6信號通路：ATF6作為內質網Ⅱ型跨膜蛋白，在ERS中轉移至高爾基體，隨即被位點蛋白酶1（site protease 1，SPl）和SP2裂解，產生bZIP轉錄因子ATF6（P50）。隨后該片段進入細胞核，結合于ERSE，激活CHOP. XBP1等ERAD相關蛋白的表達。經典的UPR反應可激活三條信號通路，但研究發現UPR信號通路也具有組織特異性，如ERS誘導物誘導B淋巴細胞分化時，只發現IRE1和ATF6通路激活。

2 ERS參與動脈粥樣硬化的機制

ERS存在于動脈粥樣硬化的各個時期，且長期的ERS被視為促動脈粥樣硬化的關鍵因素。

2.1 ERS與細胞凋亡：細胞凋亡與動脈粥樣斑塊的破裂密切相關。檢測動脈粥樣斑塊發現血管內皮細胞、血管平滑肌細胞和巨噬細胞都存在明顯的細胞凋亡。在動脈粥樣硬化后期，巨噬細胞及泡沫細胞凋亡釋放大量脂質、溶酶體酶和自由基，并增加斑塊壞死核心的體積，損傷血管內皮細胞和平滑肌細胞，進一步加重局部炎癥反應。內皮細胞凋亡破壞了血管內皮完整性，致內皮下的膠原暴露，引起血小板聚焦和附壁血栓的形成，促進oxLDL滲入粥樣斑塊，增加粥樣斑塊破裂的可能。此外，纖維帽部分的血管平滑肌細胞凋亡可影響膠原纖維分泌，致使粥樣斑塊的帽狀結構更加薄弱，促使斑塊向不穩定斑塊發展。endprint

細胞凋亡由兩條相互關聯的信號瀑布調控：內在的線粒體途徑以及外在的死亡受體（death receptor，DR）途徑。ERS對兩條信號通路都存在調節作用。研究發現，短暫的ERS可激活IREla的核酸酶活性，介導IREla依賴的衰退（IREla-dependent decay，RIDD），通過水解DR5的mRNA，抑制DR5介導的細胞凋亡持續的應激則導致IREla核酸酶活性逐漸下降，DR5 mRNA轉錄與降解間的平衡向促凋亡側傾斜，最終誘導細胞進入凋亡程序。此外，ERS還可通過CHOP蛋白影響細胞調亡。ERS激活的UPR三條信號通路（PERK-eIF2a，IREl-XBP1和ATF6）誘導轉錄因子CHOP，上調促凋亡分子GADD34、Bax、Bak、Bim，下調抑凋亡分子Bc12。CHOP蛋白可干擾內質網上的鈣釋放通道，引起內質網過度釋放，啟動細胞凋亡程序。若ERS持續狀態未得到改善，則進入最后的細胞凋亡程序。ERS在細胞調亡中的作用隨著研究的深入已逐漸清晰，控制動脈粥樣硬化斑塊的ERS可能是治療動脈粥樣硬化的一個新的策略。

2.2 ERS與細胞自噬：細胞自噬是細胞在某些生理或病理因素刺激下，損傷的細胞器和無功能蛋白被來源于內質網的雙層膜性小泡包裹，后與溶酶體融合，并被降解、回收利用的一種病理生理過程。Ox-LDL可抑制血管皮內細胞的細胞自噬，誘導細胞凋亡的發生，破壞血管內膜完整性。有研究發現，用脂聯素促進動脈粥樣斑塊內巨噬細胞的細胞自噬可穩定斑塊，抑制斑塊進展。此外，增強血管平滑肌細胞的細胞自噬可有效地抑制平滑肌細胞向泡沫細胞的轉變。ERS可激活細胞自噬一溶酶體系統參與損傷細胞器和無功能蛋白的降解，并被視為Ⅱ型ERAD，可作為ERAD的補充和替代。研究發現在動脈粥樣硬化斑塊內，多種自噬蛋白，如Beclins、自噬蛋白5（autophagy protein 5，ATG5）等表達上調。ERS誘導的細胞自噬可通過稱為“噬脂”的過程，水解細胞吞噬的脂肪滴，介導膽固醇向胞外的載脂蛋白AI轉運，調節細胞膽固醇的代謝和外流，減輕泡沫細胞脂質負荷。若抑制細胞自噬，如敲除ATG5，則可檢測到主動脈全段泡沫細胞數量和斑塊面積的顯著增加。

ERS既能增強細胞自噬也可抑制細胞自噬。研究發現，UPR下游中的ATF4、CHOP，可誘導多種ATG家族成員的表達；IREa信號通路可促進自噬小泡的形成。若通過敲除ATG16L1基因抑制細胞自噬，則UPR相關分子如GRP78、eIF2a-P、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、IRE1表達水平顯著升高。可見ERS與細胞自噬存在相互作用的關系。此外，ERO的下游通路也存在抑制細胞自噬發生的機制。在多種細胞中驗證發現，若敲除ERAD過程的腳手架蛋白一同型半胱氨酸誘導的內質網應激蛋白（homocysteine-inducible ER stress protein， Herp），可檢測到細胞自噬調節蛋白Beclinl和ATG5水平的顯著升高，以及細胞在應激下更強的存活能力。動物實驗也提示Herp敲除能增加主動脈血管細胞自噬水平，顯著延緩斑塊進展。ERS對細胞自噬的雙重作用的生理意義，如何利用細胞自噬保護性作用的同時選擇性的抑制ERS下游中抑細胞自噬信號通路，可能在動脈粥樣硬化治療方面具有重要的價值。

2.3 ERS和炎癥反應.動脈粥樣硬化目前被普遍接受是一種慢性炎癥反應過程。動脈斑塊區域可檢測到多種趨化因子高表達，并且這些趨化因子誘導單核細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等炎癥細胞進一步聚集，加劇炎癥反應，影響斑塊穩定性。ERS在循環系統和非循環系統疾病中都與炎癥反應密切相關。Wang YI等觀察到血管內皮細胞的ERS水平與血管細胞粘附因子呈正相關。Shinozaki等發現，作為UPR腳手架蛋白的Herp，可能作為炎癥誘導因子參與粥樣斑塊的形成，誘導單核細胞趨化因子1（mono-cyte chemotactic protein 1，MCPl）、TNF-a、IL-6在斑塊區域血管的表達。研究發現ERS下游分子ATF4在內皮細胞中可誘導MCP-1的表達，并磷酸化激活炎癥因子KB（nuclear factor-KB，NF-KB）和JNK[18]。此外，PERK通路中的P-eIF2a，可抑制包括NF-KB抑制物inhibitor-KB （kB）在內的大多數蛋白質的翻譯，從而增加NF-jcB的活性[19]。Nakajima等用亞麻酶細胞毒素模擬ERS中GRP78解離過程，發現細胞通過Akt-ATF6-NF-KB信號通路激活炎癥反應瀑布。近期研究發現，激活的IREa信號通路可征集腫瘤壞死因子受體相關因子2（TNF receptor-associated factor 2，TRAF2），并形成復合體，一方面激活下游分子NF-KB，另一方面啟動IKB的磷酸化降解途徑。同樣，已經有越來越多的研究證實通過藥物干預ERS或者抑制某些UPR信號，可有效抑制血管細胞的炎癥反應。

2.4 ERS與線粒體Ca2+穩態失衡：內質網和線粒體間存在天然的聯系，線粒體膜表面有約5%～20%的面積與內質網存在連接，此部分內質網膜稱為線粒體連接的內質網膜（mitochondria-associated ER mem-branes，MAM）。MAM作為多種信號通路傳遞的平臺，對線粒體融合、線粒體鈣負荷、線粒體呼吸等生理活動都有重要調節作用。MAM結構的穩定由兩者膜上的內質網線粒體融合蛋白二聚體和BiP與內質網膜sigma-1受體間的連接維持。這些MAM位點有相當高濃度的Ca2+，并通過線粒體Ca2+單向轉運體轉運進線粒體，參與Ca2+在內質網和線粒體間的快速流動。

目前，實驗中常用毒胡蘿卜素抑制內質網Ca2+-ATP酶，模擬ERS狀態下內質網Ca2+水平失調，構建細胞ERS模型。細胞ERS時常伴有Ca2+通道分子構象改變和1，4，5一三磷酸肌醇受體激活，隨后釋放內質網內Ca2+入胞漿。升高的胞漿Ca2+通過線粒體Ca2+單向轉運體進入線粒體。短期的線粒體Ca2+轉運可減輕內質網Ca2+超載，維持其正常功能，而長期轉運則會引起線粒體內穩態失衡，干擾線粒體能量代謝。導致能量障礙，進一步抑制了內質網Ca2+-ATP酶攝取胞漿Ca2+能力，加重細胞Ca2+穩態失衡，激活線粒體凋亡通路。Munoz等研究發現PERK在MAMs的Ca2+轉運功能的維持具有重要作用，提示ERS時PERK表達的上調可能加速了線粒體Ca2+超載的進程。ApoE-/-鼠體內維持細胞內Ca2+穩定，也發現可保護血管內膜的完整性，并能抑制動脈粥樣硬化斑塊的惡化。

3 小結

ERS在疾病發生發展中的作用重要且廣泛，尤其是動脈粥樣硬化這種慢性疾病。動脈粥樣硬化的轉歸由保護性反應（細胞自噬）和損傷性反應（細胞凋亡、炎癥反應、能量代謝紊亂）共同決定。ERS可誘導細胞一系列信號通路的激活，并決定細胞不同的命運。短暫的ERS反應可被UPR迅速糾正，并短時間內增強細胞對應激的抵抗能力，而持久或劇烈的ERS無法被細胞自身調節機制糾正，進一步加劇細胞功能紊亂，最終引導細胞走向死亡。ERS并不總扮演損傷性角色在心肌缺血前誘導ERS可增加心肌細胞在缺血中的存活率；在動脈粥樣硬化早期，ERS誘導的泡沫細胞凋亡可抑制斑塊面積擴大。ERS對細胞功能影響較為廣泛，如何通過精確的信號通路抑制或誘導ERS，以及調節下游保護性和損傷性反應間的平衡已成為治療動脈粥樣硬化相關疾病的重要研究熱點。但是目前我們對ERS機制的了解還不完善，仍有待于對ERS信號通路更深層次的研究。endprint