拉米夫定與IFNα-2b序貫治療對肝癌細胞HBsAg、HBeAg表達及細胞增殖的影響

丁揚，楊偉，李婧，潘曉，王雪(濰坊醫學院，山東濰坊6000;中國人民解放軍第89醫院)

拉米夫定與IFNα-2b序貫治療對肝癌細胞HBsAg、HBeAg表達及細胞增殖的影響

丁揚1，楊偉2，李婧2，潘曉1，王雪1
(1濰坊醫學院，山東濰坊261000;2中國人民解放軍第89醫院)

摘要:目的探討拉米夫定與干擾素(IFN)α-2b序貫治療對肝癌HepG2.2.15細胞HBsAg、HBeAg表達及細胞增殖的影響。方法取對數生長期HepG2.2.15細胞，分為對照組、Lam組、IFN組、聯合組和序貫組。對照組不加藥常規培養; Lam組加入5 μg/mL拉米夫定200 μL，IFN組加入10 000 IU/mL IFNα-2b 200 μL，聯合組將拉米夫定、IFNα-2b混合后加入，均培養6d;序貫組先加拉米夫定培養3d，再加IFNα-2b培養3d。采用ELISA法檢測各組HBsAg、HBeAg表達情況，MTT法檢測各組細胞增殖情況。結果實驗結束后Lam組、IFN組、聯合組、序貫組的HBsAg、HBeAg表達量均低于對照組，P均＜0.05。序貫組HBsAg、HBeAg表達量均低于Lam組、IFN組、聯合組，P均＜0.05。對照組、Lam組、IFN組、聯合組、序貫組OD值分別為1.16±0.07、1.08±0.04、0.59±0.31、0.50± 0.03、1.09±0.04，IFN組與聯合組OD值明顯低于對照組、Lam組、序貫組，P均＜0.05。其余各組兩兩比較，P＞0.05。結論拉米夫定與IFNα-2b序貫應用可以抑制HepG2.2.15細胞HBsAg、HBeAg表達，降低IFNα-2b對肝癌細胞增殖的抑制作用，提示序貫治療安全、可行。

關鍵詞:拉米夫定;干擾素;序貫療法;肝腫瘤;細胞增殖

拉米夫定、干擾素(IFN)抗HBV效果確切，但能否序貫應用仍存在爭議。有學者認為，序貫抗HBV治療可引起耐藥［1，2］;也有學者認為，序貫抗HBV治療可有效控制HBV數量，改善患者的生活質量［3］。2014年9～10月，我們觀察了拉米夫定、IFNα-2b序貫抗HBV治療對體外培養的肝癌HepG2.2.15細胞HBsAg、HBeAg抗原表達及細胞增殖的影響。現報告如下。

1　材料與方法

1.1材料人肝癌HepG2.2.15細胞株購于上海瑞鹿生物科技有限公司。取拉米夫定片(福建廣生堂股份有限公司)0.2 g研磨成粉，加入PBS 20mL配制成拉米夫定母液，4℃保存，實驗中稀釋至5 μg/mL。將重組人IFNα-2b注射液(天津華利達生物有限公司)300萬IU用蒸餾水稀釋至10 000 IU/mL。MTT試劑盒購于北京Solarbio科學技術有限公司，HBsAg與HBeAg檢測試劑盒購于北京生物技術研究所。

1.2細胞分組及干預將HepG2.2.15細胞迅速水浴后，加入含有細胞培養液的離心管中，離心棄上清，將細胞懸液置于5mL細胞培養基中，放入細胞培養箱。待細胞長成單層后，用0.25%的胰酶消化，每1周傳代1次。取對數生長期細胞接種于96孔板培養24 h，設對照組、Lam組、IFN組、聯合組和序貫組各5孔。對照組不加藥常規培養，Lam組加入拉米夫定200 μL，IFN組加入IFNα-2b 200 μL，聯合組將拉米夫定、IFNα-2b各200 μL混合后加入，均培養6d;序貫組先加拉米夫定200 μL培養3d，再加IFNα-2b 200 μL培養3d。

1.3 HBsAg、HBeAg表達檢測采用ELISA法。所有操作均嚴格按試劑盒說明書進行，于波長450 nm處用酶標儀讀取各孔吸光度(OD)值。以空白培養液為陰性對照。

1.4細胞增殖情況檢測采用MTT法。吸取各組培養孔內液體200 μL，加入新鮮培養液90 μL，再加入MTT液110 μL繼續培養4 h。取上清，每孔加入Formazan溶解液110 μL，低速振蕩10min，使結晶充分溶解。于波長490 nm處用酶標儀讀取各孔OD值。

1.5統計學方法采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以x珋±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組HBsAg、HBeAg表達比較見表1。

表1　各組HBsAg、HBeAg表達比較()

表1　各組HBsAg、HBeAg表達比較()

注:與對照組相比，*P＜0.05;與Lam組、IFN組、聯合組相比，#P＜0.05。

組別　n HBsAg　HBeAg對照組5　3.38±0.21　3.32±0.54 Lam組　5　2.87±0.31*　2.89±0.29*IFN組　5　2.40±0.17*　2.53±0.26*聯合組　5　2.46±0.41*　2.50±0.71*序貫組　5　2.08±0.33* #　2.37±0.13*#

2.2各組細胞增殖情況比較對照組、Lam組、IFN組、聯合組、序貫組的OD值分別為1.16±0.07、1.08±0.04、0.59±0.31、0.50±0.03、1.09±0.04，對照組、Lam組、序貫組OD值相比差異無統計學意義，IFN組與聯合組OD值相比差異無統計學意義，但明顯低于其余三組，P均＜0.05。

3　討論

肝癌HepG2.2.15細胞株是由兩個頭尾相連的

HBV-DNA全基因重組質粒沾染受體細胞HepG2而獲得的，可在體外增殖，在細胞培養上清中分泌HBsAg、HBeAg和完整的HBV大球形顆粒，同時還能產生大量的復制中間體，是目前各實驗室廣泛用于篩選和評價體外抗HBV藥物良好的實驗模型［4］。

拉米夫定是核苷酸類似物中的代表性藥物，能阻止HBV在肝細胞內逆轉錄過程中DNA鏈的延伸，使病毒停止擴增。但拉米夫定對HBV環DNA無直接清除作用［5］，只有長期使用才能維持病毒低表達水平，易誘導病毒產生耐藥變異，導致用藥期間病毒反跳。IFNα-2b是一種多功能免疫調節因子，可誘導細胞產生抗病毒蛋白，具有特殊的抗病毒作用。其抗HBV的機制可能涉及以下方面:①通過細胞內信號轉導途徑，激活細胞內相關酶，直接降解HBV的DNA或mRNA，介導NK、NKT、CTL等免疫細胞吞噬HBV感染的肝細胞;②誘導感染HBV的肝細胞死亡;③刺激巨噬細胞吞噬HBV顆粒等［6］。體外實驗證實，拉米夫定、IFNα-2b序貫治療對HepG2.2.15細胞HBsAg、HBeAg表達的抑制作用強于二者單獨或聯合應用［7］。其可能機制是由于拉米夫定在HepG2.2.15細胞內磷酸化，在HBV復制過程中磷酸化的拉米夫定與dCTP競爭起到抗病毒作用，拉米夫定協同IFNα-2b可通過誘導2'-5'寡聚腺苷酸合成酶降解HBV RNA，進而導致HBsAg、HBeAg表達下調。

IFNα-2b單獨應用細胞毒性較強。本研究顯示，IFNα-2b對HepG2.2.15細胞增殖的抑制作用強于拉米夫定，但兩者聯合以及序貫應用時，拉米夫定可以減輕IFNα-2b對細胞增殖的抑制作用。IFNα-2b對不表達HBV的HepG2細胞無細胞增殖抑制作用，而對HepG2.2.15細胞有明顯的致細胞凋亡作用［8］。其主要原因在于IFNα-2b對HepG2.2.15細胞增殖的抑制作用與HBV的表達呈正相關［9，10］，因此IFNα-2b很難單獨作為抗病毒藥物在臨床上應用。

綜上所述，在拉米夫定和IFNα-2b序貫治療中，拉米夫定可抑制HepG2.2.15細胞HBV復制，降低IFNα-2b的細胞增殖抑制作用。

參考文獻:

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收稿日期:( 2014-10-31)

文章編號:1002-266X(2015)34-0022-02

文獻標志碼:A

中圖分類號:R735.7

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.34.008