饑餓對大鼠大腦皮質自噬相關蛋白LC3、Beclin 1表達的影響

褚迎欣，張建凱，程光，張樹波，高曉增，劉鐵軍，張小平(華北理工大學附屬醫院，河北唐山063000)

饑餓對大鼠大腦皮質自噬相關蛋白LC3、Beclin 1表達的影響

褚迎欣，張建凱，程光，張樹波，高曉增，劉鐵軍，張小平
(華北理工大學附屬醫院，河北唐山063000)

摘要:目的觀察饑餓對大鼠大腦皮質微管相關蛋白1輕鏈3( LC3)、Beclin 1自噬相關蛋白表達的影響。方法將70只SD大鼠隨機分為3組，對照組10只、短期組30只(饑餓1、2、3 d各10只)、長期組30只(饑餓5、7、9 d各10只)。對照組正常飲食，短期組和長期組均采取全饑餓處理。對照組于饑餓起點、短期組與長期組分別于相應饑餓終點斷頭取腦，采用Western blot法檢測大腦皮質的LC3與Beclin 1。結果短期組饑餓3 d大腦皮質LC3 與Beclin 1較對照組表達上調( P＜0.05、0.01)，長期組較對照組及短期組大腦皮質LC3與Beclin 1表達上調( P均＜0.01)。短期組饑餓1 d與2 d時大腦皮質LC3、Beclin 1表達比較，P均＞0.05;長期組饑餓7 d與9 d時大腦皮質Beclin 1表達比較，P＞0.05。結論短期饑餓2 d內大鼠大腦皮質LC3、Beclin 1表達未發生明顯改變，隨饑餓時間延長，大鼠大腦皮質LC3與Beclin 1表達上調。

關鍵詞:自噬;饑餓;大腦皮質;微管相關蛋白1輕鏈3;自噬相關蛋白

自噬是細胞內的物質成分利用溶酶體被降解過程的統稱，自噬體形成是其過程中一重要階段［1］。微管相關蛋白1輕鏈3( LC3)是自噬體膜上的標記蛋白［2］，Beclin 1在自噬體形成過程中發揮重要調控作用［3］，二者的表達變化可在某種程度上反映自噬的激活。體外細胞實驗表明，營養缺乏是自噬發生的激活劑［4，5］。機體對饑餓狀態代謝反應的整體調節是復雜變化的，自噬本身也是一個隨時間動態變化的過程。腦作為神經中樞，其對饑餓引起的應激反應具有特殊性。2013年9月～2014年12月，我們觀察了饑餓對大鼠大腦皮質自噬相關蛋白LC3、Beclin 1表達的影響?，F報告如下。

1　材料與方法

1.1材料3月齡健康雄性SPF級SD大鼠70只，體質量330～370 g，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心［許可證號: SCXK-(軍) 2009-003］。于室溫20～24℃、相對濕度45%～55%、通風良好、12 h晝夜節律、氨濃度＜14 mg/m3條件下，用標準鼠飼料適應性喂養1周。兔抗大鼠LC3多克隆抗體( MBL公司，日本)，兔抗大鼠Beclin 1多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，SP-9001免疫組化檢測試劑盒、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司) ; BX61金相研究級正立顯微鏡( Olympus公司，日本)，蛋白電泳儀、濕電轉膜儀( Bio-RAD公司，美國)。

1.2動物分組與處理將70只大鼠單籠飼養1周，以體質量作為分層因素隨機分為對照組10只、短期組30只(饑餓1、2、3 d各10只)和長期組30 只(饑餓5、7、9 d各10只)。對照組正常飲食，短期組和長期組采取全饑餓處理(無飼料供應，自由飲水)。以饑餓開始當日上午8時作為饑餓起點，以饑餓時間達相應時點的上午8時作為饑餓終點。對照組于饑餓起點、短期組與長期組于相應饑餓終點，腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，斷頭取腦，迅速分離出大腦皮質，－80℃冰箱保存備用。

1.3大鼠大腦皮質LC3、Beclin 1表達檢測采用Western blot法。取低溫凍存的腦組織，切碎后置于玻璃勻漿器中。根據組織凈重，按1∶10加入相應體積預冷的裂解液;冰浴研磨勻漿，靜置至充分裂解; 4℃12 000 r/min離心20 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。向蛋白樣品中加入5×上樣緩沖液，沸水中變性5 min。每孔總蛋白上樣50 μg，行SDSPAGE凝膠電泳;將蛋白濕轉至PVDF膜，TBST洗膜10 min×3次; 5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h后，加入兔抗大鼠LC3一抗( 1∶1 000)、兔抗大鼠Beclin 1一

抗( 1∶500)，以β-actin作為內參，4℃孵育過夜。TBST洗膜10 min×3次，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗( 1∶5 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜20 min×3次。向膜上滴加ECL化學發光試劑并使之與膜充分接觸1 min，暗室曝光、顯影、定影，圖像掃描。采用Image J軟件對條帶進行分析，以目的蛋白條帶與內參條帶灰度比值作為LC3、Beclin 1相對表達量。

1.4統計學方法采用SPSS 13.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較采用雙向分類的方差分析，多重比較選用Dunnett-t檢驗與LSD-t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

三組大腦皮質LC3、Beclin 1蛋白相對表達量比較，見表1。

表1　三組大腦皮質LC3、Beclin 1蛋白相對表達量比較(±s)

表1　三組大腦皮質LC3、Beclin 1蛋白相對表達量比較(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05，#P＜0.01;與短期組比較，ΔP＜0.01。

組別　n LC3　Beclin 1短期組饑餓1 d　 5　0.20±0.03　0.22±0.03饑餓2 d　 5　0.22±0.04　0.23±0.04饑餓3 d　 5　0.36±0.06*　0.40±0.06#長期組饑餓5 d　 5　0.80±0.08#Δ　0.65±0.08#Δ饑餓7 d　 5　1.41±0.08#Δ　1.11±0.10#Δ饑餓9 d　 5　1.63±0.09#Δ　1.05±0.11#Δ對照組5　0.19±0.03　0.20±0.03

3　討論

生理狀態下，細胞自噬保持在一個較低的水平，主要用于清除衰老或損傷的細胞器和蛋白質的轉化。在營養缺乏、缺氧、蛋白質錯誤折疊及胞內病原菌感染等應激情況下，自噬增強。饑餓條件下，自噬可降解胞內物質，產生代謝中間產物以滿足細胞需求，維持細胞穩態［8］。

自噬過程由一系列自噬相關基因( Atg)編碼的對應蛋白參與完成，LC3是酵母Atg8在哺乳動物中的同源物，細胞內LC3蛋白的存在形式主要有LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ兩種。LC3-Ⅰ散在分布于細胞質內，在自噬體形成階段，LC3-Ⅰ與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺結合形成LC3-Ⅱ; LC3-Ⅱ穩定地定位在自噬體的內外膜上，直到自噬體與溶酶體融合后，被溶酶體水解酶降解［9］。在Western blot檢測中，LC3-Ⅱ與抗體的結合能力強于LC3-Ⅰ，即LC3-Ⅱ的檢測敏感性高于LC3-Ⅰ［10］。本研究結果顯示，短期組饑餓1、2 d者較對照組大腦皮質LC3表達差異無統計學意義，表明短期饑餓處理2 d內大腦皮質自噬體數量未發生明顯變化。Mizushima等［11］研究顯示，饑餓誘導24、48 h，在小鼠的肝臟等大部分組織器官中可觀察到自噬的激活，但在大腦、小腦中未觀察到自噬水平的升高。本研究結果與之一致，提示饑餓對自噬的誘導效應存在組織器官特異性。此外，饑餓初期，在機體代謝的整體調節下，肝糖原分解增加，且肝細胞發生自噬，降解細胞內的蛋白質;肝糖異生增加在一定程度上維持了腦組織的能量供應［12］，致使腦組織中對營養和能量缺乏敏感的mTORC1與AMPK等自噬通路［13～15］的相關調控信號水平未發生明顯改變。本研究進一步觀察結果顯示，長期組較對照組及短期組LC3表達上調。表明隨著饑餓時間的延長，自噬體水平增高。然而，長期饑餓狀態下大鼠大腦皮質自噬體數量顯著增多，可能與自噬體生成的增多和(或)自噬體降解減少有關。

Beclin 1是酵母Atg6基因在哺乳動物中的同源物［16］。Beclin 1蛋白可通過與Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶( Vps34)形成復合物參與自噬，且Beclin 1/Vps34復合物可作為一種招募平臺使其他Atg蛋白定位于前自噬體而促進自噬體的形成。內源性的Beclin 1定位于反面高爾基網、線粒體、核周膜和內質網［17］。研究表明，Beclin 1具有Bcl-2結合結構域、BH3結構域和細胞核輸出信號( NES)等5個結構域［18］。其中，Bcl-2與Beclin 1相互作用并干擾Vps34和Beclin 1形成復合物;而NES可將Beclin 1從細胞核運送到胞質中，并以這種胞質形式調節自噬［19］。本研究結果顯示，短期組饑餓1、2 d較對照組Beclin 1表達差異無統計學意義，饑餓3 d表達上調，長期組較對照組及短期組Beclin 1表達上調。饑餓條件下Bcl-2在內質網中發生磷酸化，導致Bcl-2與Beclin 1之間的相互作用下降［20］，也可刺激自噬。須注意的是，本研究長期組饑餓9 d與饑餓7 d比較，Beclin 1表達差異無統計學意義，但LC3表達差異有統計學意義。提示長期饑餓狀態下，自噬功能發生紊亂，如長期的營養與能量缺乏可造成溶酶體、線粒體等細胞器結構和功能的破壞，進而導致自噬溶酶體降解能力下降，使自噬體出現蓄積。

參考文獻:

［1］Reggiori F，Klionsky DJ.Autophagy in the eukaryotic cell［J］.Eukaryot Cell，2002，1( 1) : 11-21.

［2］Tanida I，UenoT，Kominami E.LC3 conjugation system in mammalian autophagy［J］.Int J Biochem Cell Biol，2004，36( 12) : 2503-2518.

［3］Takahashi Y，Coppola D，Matsushita N，et al.Bif-1 interacts with Beclin-1 through UVRAG and regulates autophagy and tumorigenesis［J］.Nat Cell Biol，2007，9( 10) : 1142-1151.

［4］Onodera J，Ohsumi Y.Autophagy is required for maintenance of amino acid levels and protein synthesis under nitrogen starvation ［J］.J Biol Chem，2005，280( 36) : 31582-31586.

［5］Inoki K，Zhu T，Guan KL.TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival［J］.Cell，2003，115 ( 5) : 577-590.

［6］Robin JP，Frain M，Sardet C，et al.Protein and lipid utilization during long-term fasting in emperor penguins［J］.Am J Physiol，1988，254( 1) : 61-68.

［7］丁玉琴，郭俊生，趙法伋，等.泛酸鈣對全饑餓鼠存活時間、尿氮排出與學習記憶影響的實驗研究［J］.解放軍預防醫學雜志，2002，20( 1) : 12-16.

［8］Shintani T，Klionsky DJ.Autophagy in health and disesse: a double-edged sword［J］.Science，2004，306( 5698) : 990-995.

［9］Kimura S，Fujita N，Noda T，et al.Mornitoring autophagy in mammalian cultured cells through the dynamics of LC3［J］.Methods Enzymol，2009( 452) : 1-12.

［10］Mizushima N，Yoshimori T.How to interpret LC3 immunoblotting ［J］.Autophagy，2007，3( 6) : 542-545.

［11］Mizushima N，Yamamoto A，Matsui M，et al.In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a flurescent autophagosome marker［J］.Mol Biol Cell，2004，15( 3) : 1101-1111.

［12］Peters A，Schweiger U，Pellerrin L，et al.The selfish brain: competition for energy resources［J］.Neurosci Biobehav Rev，2004，28 ( 2) : 143-180.

［13］Jung CH，Ro SH，Cao J，et al.mTOR regulation of autophagy ［J］.FEBS Lett，2010，584( 7) : 1287-1295.

［14］Kim J，Kundu M，Viollet B，et al.AMPK and mTOR regulate autophagy through direct phosphorylation of Ulk1［J］.Nat Cell Biol，2011，13( 2) : 132-141.

［15］Russell RC，Yuan HX，Guan KL.Autophagy regulation by nutrient signaling［J］.Cell Res，2014，24( 1) : 42-57.

［16］Liang XH，Jackson S，Seaman M，et al.Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin 1［J］.Nature，1999，402 ( 6762) : 672-676.

［17］Pattingre S，Tassa A，Qu X，et al.Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit Beclin 1-dependent autophagy［J］.Cell，2005，122( 6) : 927-939.

［18］Furuya N，Yu J，Byfield M，et al.The envolutionarily conserved domain of Beclin 1 is required for Vps34 binding，autophagy，and tumor suppressor function［J］.Autophagy，2005，1( 1) : 46-52.

［19］Liang XH，Yu J，Brown K，et al.Beclin 1 contains a leucine-rich nuclear export signal that is required for its autophagy and tumor suppressor function［J］.Cancer Res，2001，61( 8) : 3443-3449.

［20］Wei Y，Pattingre S，Sinha S，et al.JNK-mediated phosphorylation of Bcl-2 regulates starvation-induced autophagy［J］.Mol Cell，2008，30( 6) :678-688.

收稿日期:( 2015-03-27)

通信作者:張小平

文章編號:1002-266X( 2015)30-0023-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R363

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.30.008