三氧化二砷聯合塞來昔布對上皮性卵巢癌細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用

張　蕾　薛永飛　任中海

(南陽市中心醫院腫瘤內二科，河南　南陽　473000)

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三氧化二砷聯合塞來昔布對上皮性卵巢癌細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用

張蕾薛永飛任中海

(南陽市中心醫院腫瘤內二科，河南南陽473000)

摘要〔〕目的探討三氧化二砷(As2O3)聯合塞來昔布(celecoxib)對上皮性卵巢癌細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用及其機制。方法以上皮性卵巢癌細胞株(OVCAR-3)為研究對象，As2O3、celecoxib及兩藥聯合作用于細胞株48 h后，噻唑藍(MTT)法體外檢測藥物對細胞增殖抑制作用，并采用金正均q值法計算聯合用藥的q值。采用凋亡染色和流式細胞儀(FCM)檢測藥物對細胞凋亡和細胞周期影響，蛋白質印跡法(Western印跡)檢測Bcl-2和caspase-3凋亡相關蛋白的表達水平。結果As2O3和celecoxib對OVCAR-3細胞呈劑量依賴性的生長抑制作用，As2O3的半數抑制濃度(IC50)為4.00 μmol/L，celecoxib的IC50為40.00 μmol/L；As2O3和celecoxib聯合用藥后，OVCAR-3細胞的增殖抑制率和凋亡率均大于單藥作用組(P<0.05)，聯合用藥的q值>1.15，有顯著的協同抗腫瘤效應。 As2O3和celecoxib聯合用藥后OVCAR-3細胞發生明顯的G2/M期阻滯，Bc1-2表達明顯下調，而caspase-3表達則明顯上調(P< 0.05)。結論As2O3和celecoxib單藥對OVCAR-3細胞的生長均有抑制作用，聯合用藥具有顯著的協同作用。As2O3和celecoxib聯合用藥對于上皮性卵巢癌的藥物治療有重要的應用前景。

關鍵詞〔〕卵巢癌;三氧化二砷;塞來昔布;細胞增殖;細胞凋亡

第一作者：張蕾(1978-)，女，主治醫師，主要從事腫瘤內科方面的研究。

上皮性卵巢癌近年呈上升趨勢，死亡率居首位〔1〕。卵巢癌浸潤、轉移是造成卵巢癌治療困難的主要原因〔2〕。三氧化二砷(As2O3)對卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌等各種實體瘤有較強的治療作用，其機制主要為誘導細胞凋亡、提高細胞內活性氧簇(ROS)水平、抑制核因子、清除腫瘤干細胞等〔3，4〕。塞來昔布(celecoxib)是環氧合酶-2抑制劑靶向藥物，具有抗感染與抗腫瘤作用。celecoxib的抗腫瘤機制為對腫瘤細胞的增殖抑制和凋亡誘導雙重效應。celecoxib對卵巢癌、非小細胞肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤細胞均具有增殖抑制作用〔5～7〕。臨床試驗顯示，As2O3單藥對實體瘤療效有限，與其他化療藥物聯合使用則顯示出可觀的療效〔8〕。本研究以上皮性卵巢癌細胞株(OVCAR-3)為研究對象，探討As2O3聯合celecoxib對上皮性卵巢癌細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用及其機制。

1材料與方法

1.1細胞系及主要試劑OVCAR-3由中山大學腫瘤防治中心惠贈。1640培養液購自天津海康龍公司，胎牛血清(FBS)購自天津海康龍公司。亞砷酸注射液(主要成分為As2O3和NaCl)購自哈爾濱伊達藥業有限公司，Celecoxib標準品(購自白廣州優瓦儀器有限公司，純度99.5%)。胰蛋白酶、噻唑藍(MTT),二甲基亞砜(DMSO)等(購自Sigma-Aldrich公司)，B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2),半胱氨酸蛋白酶蛋白-3(caspase-3)、β-肌動蛋白(β-actin)鼠抗人單克隆抗體、羊抗鼠IgG等(購自美國BD公司)，丙烯酞胺、十二烷基磺酸鈉和聚偏二氟乙烯膜(PDVF)等(購自美國Amresco公司)。蛋白提取試劑盒和化學發光檢測試劑盒(購自上海生工生物工程有限公司)。高倍顯微鏡(美國 Leica-M841 型)，高速冷凍離心機(美國 Heal Force)，流式細胞儀(FCM)(美國 Accuri)，快速溫度梯度PCR儀(美國 Bio-RAD)，熒光定量PCR反應機(美國 Agilent)，瓊脂糖電泳儀(美國 Bio-RAD)，酶聯免疫儀(美國 BioTek)，37℃ CO2培養箱(上海新苗)。

1.2細胞培養復蘇OVCAR-3細胞用含10% FBS的640培養液，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養箱中貼壁培養，細胞呈貼壁生長。隔日換液。在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，每3～4 d用0.25%胰酶消化并按1∶2傳代。

1.3藥物干預及MTT法檢測細胞增殖取對數生長期的細胞，調整濃度至每孔1×104個細胞接種至96 孔板中，細胞貼壁后，常規培養24 h，用含不同濃度藥物的培養液繼續培養。藥物干預方法為As2O3、celecoxib及兩藥聯合三組。As2O3組等比設置1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、32.00 μmol/L 6個濃度，celecoxib組等差設置10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100 μmol/L 6個藥物濃度，兩藥聯合組設置1.00 μmol/L As2O3+10.00 μmol/L celecoxib、2.00 μmol/L As2O3+20.00 μmol/L celecoxib以及4.00 μmol/L As2O3+ 40.00 μmol/L celecoxib三組。實驗均設置空白組，且每孔最終反應體系中DMSO的濃度均小于0.03%。48 h 后，每孔加 MTT 20 μl，繼續孵育 4 h后小心吸棄上清液，每孔加入150 μl的DMSO，振蕩10 min，在酶標儀上570 nm波長下測定吸光度值A，細胞存活率(M)=藥物組A值/空白組A值。實驗重復3次。細胞增殖抑制率(E)=〔1-M/(陰性對照組A值-空白組A值)〕×100%。單藥實驗中，繪制細胞生長曲線，計算各藥物作用的半數抑制濃度(IC50)。按金正均q值法公式〔q=E(a+b)/(Ea+Eb)-Ea×Eb〕計算(a為As2O3，b為celecoxib)，評價兩種藥物聯合的協同或拮抗效應，q值為0.85～1.15時，兩藥合呈單純相加效應，q>1.15時，兩藥合用具有協同效應，q<0.85時，兩藥具有拮抗效應。

1.4凋亡染色法檢測細胞凋亡取培養的單細胞懸液，計數細胞約為1.5×105，根據細胞表面及細胞內染色步驟進行細胞染色，事先進行染色分組，設置好空白組，EP管中加入As2O3、celecoxib及兩藥聯合藥液。用錫箔紙包裹避光放入37℃，CO2培養箱中培養5 h，取出后以2 000 r/min離心5 min，棄上清，沖洗后加入50 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)后按分組進行Hoechest33258染色，避光在4℃環境下繼續培養15 min，倒置熒光顯微鏡下觀察單藥及聯合作用的細胞凋亡的形態特征，包括細胞體積縮小、核固縮、染色質邊集和凋亡小體形成等。

1.5FCM檢測細胞凋亡和周期分布OVCAR-3培養24 h后以單藥及二者聯合用藥處理細胞48 h，并設陰性對照。收集細胞，PBS洗滌，用預冷的70%乙醇溶液固定，離心5 min，再用1% 無DNA酶活性的RNA酶(NAase)和碘化丙啶(PI)染液處理，FCM檢測凋亡率及細胞周期分布情況。實驗重復3次。

1.6Western印跡檢測凋亡相關蛋白的表達對數生長期細胞，經單藥以及兩藥聯合作用48 h后，常規方法提取總蛋白。設立陰性對照組。行十二烷基硫酶鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離蛋白電泳，轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫3% FBS封閉60 min，加入白蛋白稀釋的Bcl-2、caspase-3、β-actin抗體，輕搖過夜，TBST(Tris-Hcl,NaCl,tween20)漂洗4次，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG反應60 min，TBST漂洗4次，加入增強化學發光(ECL)試劑反應3 min。以目的蛋白條帶的灰度值/內參條帶的灰度值表示目的蛋白的相對表達量。

1.7統計學方法應用SPSS19.0軟件進行Spearman等級相關檢驗、χ2檢驗、t檢驗，IC50值的計算采用概率單位法。

2結果

2.1對OVCAR-3細胞增殖的抑制作用MTT結果顯示，1.00 μmol/L As2O3和10.00 μmol/L celecoxib對OVCAR-3細胞的抑制作用不明顯，分別為(5.2±0.9)%、(5.4±0.6)%(P>0.05)，16.00 μmol/L As2O3〔(86.7±2.3)%〕、32.00 μmol/L As2O3〔(88.9±2.4)%〕、80.00 μmol/L celecoxib〔(81.1±1.9)%〕、100.00 μmol/L celecoxib〔(83.2±1.9)%〕以及4.00 μmol/L As2O3+40.00 μmol/L celecoxib〔(90.4±2.3)%〕、1.00 μmol/L As2O3+10.00 μmol/L celeooxib〔(56.7±1.7)%〕、2.00 μmol/L As2O3+20.00 μmol/L cellcoxib〔(89.3±2.1)%〕對OVCAR-3細胞的抑制作用減弱(P<0.05)。2.00、4.00、8.00 μmol/L As2O3〔(15.1±1.31)%、(49.5±1.4)%、(83.7±2.1)%〕和20.00、40.00、60.00 μmol/L celecoxib〔(13.7±1.5)%、(50.6±1.2)%、(68.9±1.8)%〕對OVCAR-3細胞均具有顯著的劑量依賴性抑制作用(P<0.05)，As2O3的IC50值為4.00 μmol/L，celecoxib的IC50為40.00 μmol/L；As2O3聯合celecoxib后，OVCAR-3細胞的增殖抑制率均高于同濃度As2O3和celecoxib單藥的抑制率(P<0.05)。其中1.00 μmol/L As2O3為11.24%，2.00 μmol/L As2O3為15.1%，10.00 μmol/L celecoxib為8.76%，20.00 μmol/L celecoxib為13.7%，1.00 μmol/L As2O3+10.00 μmol/L celecoxib為56.7%，2.00 μmol/L As2O3+ 20.00 μmol/L celecoxib為89.3%。1.00 μmol/L As2O3+10.00 μmol/L celecoxib聯合用藥的q值為2.83，2.00 μmol/L As2O3+20.00 μmol/L celecoxib聯合用藥的q值為3.08。As2O3和celecoxib兩藥聯合作用對OVCAR-3細胞具有顯著的協同抗腫瘤效應。

2.2對OVCAR-3細胞凋亡的影響OVCAR-3細胞經不同濃度的As2O3和celecoxib作用后，均能觀察到細胞體積縮小、核固縮、染色質邊集以及凋亡小體形成等細胞凋亡。As2O3和celecoxib兩藥聯合后凋亡細胞數明顯多于As2O3和celecoxib單藥組。FCM結果顯示，As2O3和celecoxib單藥組VCAR-3細胞凋亡率均呈藥物濃度依賴性改變。2.00 μmol/L As2O3+20.00 μmol/L celecoxib聯合用藥后OVCAR-3細胞凋亡率最嚴重(P<0.05)。見表1。

表1　單藥以及兩藥聯合對OVCAR-3細胞凋亡的影響

與空白組比較:1)P<0.05；與任一單藥比較:2)P<0.05

2.3對OVCAR-3細胞周期的阻滯作用FCM結果顯示，OVCAR-3細胞分別經As2O3和celecoxib單獨處理后，細胞周期G1和S的影響不明顯(P>0.05)，而對細胞周期G2/M阻滯明顯(P<0.05)。2.00 μmol/L As2O3+20.00 μmol/L celecoxib聯合用藥后OVCAR-3細胞周期G2/M阻滯最明顯(P<0.05)，見表1。

2.4對OVCAR-3細胞中凋亡相關蛋白表達的影響Western印跡OVCAR-3細胞經2.00 μmol/L As2O3和40 μmol/L celecoxib單藥及1.00 μmol/L As2O3+10.00 μmol/L celecoxib聯合作用后，與空白組Bcl-2 0.97,caspase-3 0.85比較，聯合用藥組的凋亡抑制蛋白Bcl-2表達明顯下調，分別為0.57，0.52，0.28；而激活型蛋白caspase-3的表達水平上調，分別為1.42，1.57，2.34(P<0.05)。

3討論

上皮性卵巢癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤之一，目前以手術加化療為主要治療手段。化療在上皮性卵巢癌的治療中具有舉足輕重的地位。國內學者報道，celecoxib與As2O3聯合用藥對慢性粒細胞白血病原代細胞融合蛋白的表達及相關信號轉導通路具有協同抑制作用〔9〕。一般化療藥和抗代謝藥物與celecoxib聯合應用在如膀膚癌、肝癌和卵巢癌中有報道且療效較好〔4，5，10〕。

As2O3和celecoxib聯合用藥的協同機制可能與腫瘤細胞的凋亡機制有關，為驗證其作用機制，結果表明，熒光顯微鏡凋亡染色顯示As2O3和celecoxib兩藥聯合后凋亡細胞數明顯多于As2O3和celecoxib單藥組。通過研究有力證明了在上皮性卵巢癌細胞中As2O3和celecoxib聯合用藥協同抗腫瘤效應機制與細胞凋亡密切相關。

細胞凋亡與Bcl-2蛋白密不可分，Bcl-2為抗凋亡蛋白，細胞凋亡時Bcl-2表達受到抑制，線粒體膜通透性被破壞，細胞色素C等釋放〔11〕。活化caspase-3切割底物使細胞發生凋亡。活化的caspase-3是級聯反應中關鍵的蛋白酶，是多種凋亡途徑的共同下游效應部分〔12〕。提示As2O3和celecoxib聯合用藥誘導腫瘤細胞凋亡時線粒體凋亡通路起到了重要作用。

綜上，As2O3和celecoxib單藥對OVCAR-3細胞的生長均有抑制作用，聯合用藥具有顯著的協同作用。As2O3和celecoxib聯合用藥對于上皮性卵巢癌的藥物治療有重要的應用前景。

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〔2014-12-09修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：任中海(1968-)，男，碩士，主任醫師，主要從事腫瘤內科方面的研究。

中圖分類號〔〕R737.31〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6059-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.023