線粒體損傷及其在心肌細胞損傷中的作用

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線粒體損傷及其在心肌細胞損傷中的作用

薛大忠趙自剛牛春雨

(河北北方學院微循環研究所，河北張家口075000)

關鍵詞〔〕線粒體；心肌細胞；細胞凋亡

牛春雨(1967-)，男，博士，教授，碩士生導師，主要從事創傷休克病研究。

第一作者：薛大忠(1982-)，男，碩士，講師，主要從事創傷休克研究。

重度失血、嚴重缺氧或酸中毒及膿毒血癥均可引起心臟能量代謝障礙，使循環功能急劇減退，組織器官微循環灌流嚴重不足，導致重要生命器官功能、代謝嚴重障礙，嚴重影響治療及預后，成為危重患者死亡的重要原因之一〔1〕。線粒體損傷已成為心肌細胞結構損傷與功能障礙的基本環節〔2〕。關于線粒體在多種致病因素導致心肌細胞損傷與功能障礙中的作用，目前認為與呼吸鏈酶類變化、一氧化氮(NO)釋放、鈣超載、線粒體跨膜電位(△φm)下降、促細胞凋亡蛋白過表達、線粒體通透性轉換孔(mPTP)開放等因素有關〔3〕。本文重點綜述引起線粒體損傷的一些因素及其在心肌損傷中的作用。

1呼吸鏈酶類的變化

糖、脂及氨基酸在線粒體被氧化后釋放能量，轉變為三磷酸腺苷(ATP)分子末端高能鍵，為機體提供能量。因此，線粒體是細胞內呼吸和產生ATP的主要場所。與內呼吸作用相關的過程包括檸檬酸循環、三羧酸循環、電子傳遞、質子泵和二磷酸腺苷(ADP)磷酸化(即ATP合成)；直接影響內呼吸的酶包括呼吸鏈各種酶復合物、琥珀酸脫氫酶(SDH)，此外，細胞色素(Cyt)-c在線粒體呼吸鏈中也起著重要作用。呼吸鏈是線粒體氧化磷酸化的電子傳遞鏈，它位于線粒體內膜。呼吸鏈的電子傳遞由5個酶復合物構成(復合物Ⅰ～Ⅴ)，其中，復合物Ⅰ～Ⅳ是主要組成部分，其活性能直接或間接地反映線粒體的呼吸功能。在呼吸鏈的電子傳遞過程中，電子由復合物Ⅰ或Ⅱ通過泛醌依次傳遞給復合物Ⅲ、Cyt-c、復合物Ⅳ，2e最終傳遞給氧生成O2-，后者與基質中的2H+結合生成水。

1.1復合物Ⅰ即還原型輔酶(NAD)I-Q還原酶，又稱為NADH脫氫酶，相對分子質量為88 kD，包含34條以上的肽鏈，分別由細胞核和線粒體兩個不同的基因組編碼構成，是電子傳遞鏈中3個質子泵中的第一個質子泵。它的作用是先與NADH結合并將NADH上的兩個高勢能電子轉移到其核黃素-5-磷酸(FMN)輔基上，使NADH氧化，并使FMN還原，反應如下：NADH+H+FMN →FMNH2+NAD。接著輔基FMNH2上的電子又轉移到鐵-硫聚簇Fe-S上，最后，電子被傳遞給輔酶(Co)Q，由CoQ將電子轉移到細胞色素還原酶(復合物Ⅲ)。

1.2復合物Ⅱ即琥珀酸-Q還原酶，嵌于線粒體內膜。完整的酶還包括檸檬酸循環中是琥珀酸氧化為延胡索酸的琥珀酸脫氫酶。還原型黃素二核苷酸(FADH2)作為該酶的輔基在傳遞電子時并不與酶分離，只是將電子傳遞給琥珀酸脫氫酶分子的鐵-硫聚簇(含有2Fe-2S、3Fe-3S和4Fe-4S)。電子經過鐵-硫聚簇又傳遞給CoQ，而進入電子傳遞鏈。琥珀酸-Q還原酶的CoQ輔基和NADH還原酶輔基具有完全相同的結構和性質。

1.3復合物Ⅲ即Cyt-c還原酶，由包含3個細胞色素和硫鐵蛋白的兩個單體以二聚體的形式存在。其作用是將電子傳遞給Cyt-c，傳遞過程通過CoQ被氧化還原的過程是釋放質子來實現的，在線粒體內膜還原型CoQ被氧化為半醌，被復合物Ⅰ或細胞色素b還原為氫醌。一對電子傳遞到復合物Ⅲ中將有4個質子釋放到膜間隙中，其中2個質子是CoQ轉移的。

1.4復合物Ⅳ即Cyt-c氧化酶，是呼吸鏈的標志酶，也具有質子泵的作用，可將H+由基質抽提到膜間隙，通過血紅素中鐵原子的氧化還原變化，把Cyt-c的4個電子傳遞給還原的氧形成水，同時跨膜轉運4個質子，是呼吸電子傳遞鏈的第4個中心酶復合物。質子的轉運能夠形成電化學勢能差，從而被ATP合酶用于合成ATP。Cyt-c的4個電子在復合物Ⅳ催化過程中，都是通過Cyt-c氧化酶CuA和Cyta傳遞到Cyt a3-CuB雙核中心，經過在中心發生的氧化、還原反應，整個反應將一個氧氣分子還原為2個水分子。在缺血缺氧情況下，心肌細胞復合物Ⅳ活性下降，直接影響線粒體的氧化磷酸化過程，可導致線粒體呼吸鏈電子傳遞中斷，減少ATP生成〔4〕。實驗研究表明，急性低氧狀態下，心肌細胞線粒體呼吸鏈的酶復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的活性顯著降低；經過慢性間斷低氧暴露后，三者活性顯著提高〔5〕；提示急性低氧可使線粒體呼吸功能受損，從而引起心肌能量代謝障礙，這是急性低氧后心肌舒縮功能障礙的主要原因之一。

1.5Cyt-c表面帶正電荷，存在于線粒體嵴上，與其他氧化酶排列成呼吸鏈，不能自由通過線粒體外膜，是生物氧化過程中的電子傳遞體。在酶存在的情況下，Cyt-c對組織的氧化、還原有迅速的酶促作用。生理條件下，Cyt-c不能進入細胞；缺氧引起細胞膜通透性增高后，Cyt-c便有可能進入細胞及線粒體內，增強細胞氧化，能提高氧的利用。在此同時，對細胞也發揮一定的損傷作用。研究表明，從線粒體中泄露出的Cyt-c能夠誘導細胞凋亡；實驗顯示，多種細胞凋亡伴隨著胞質中Cyt-c釋放，而敲除了Cyt-c基因的細胞對凋亡具有明顯的耐受性，可見，Cyt-c是線粒體介導細胞凋亡途徑中不可缺少的重要因子〔5～7〕。病理狀態下，Cyt-c通過內膜釋放到胞質，為復合物Ⅳ傳遞電子數量減少，導致電子載體超載，尤其是復合物Ⅰ和Ⅲ〔8〕。電子被迫從呼吸鏈中釋放出來與O2產生超氧陰離子，進一步積累后可形成過氧化氫(H2O2)和其他活性氧(ROS)。ROS過量可氧化脂質、DNA和蛋白質，促使各種酶失活，這些損害最終導致細胞凋亡或壞死〔9，10〕。ROS的脂質氧化作用能進一步破壞線粒體內膜，促進Cyt-c釋放到胞質；ROS又能通過與線粒體外膜上的電壓依賴性陰離子通道、Bcl-2蛋白家族的相互作用，促進Cyt-c向胞質釋放。這樣，Cyt-c與ROS形成了正反饋〔11〕。

1.6琥珀酸脫氫酶屬黃素酶類，是線粒體內膜的結合酶，由含有黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和2個鐵硫簇的α和含有一個鐵硫簇β兩個亞基組成，是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，與Cyt-c氧化酶同為線粒體氧化的標志酶，可作為評價三羧酸循環運行程度的指標。該酶以FAD作為其脫下電子的受體，而不是NAD+。琥珀酸脫氫酶與FAD以共價鍵連接，因此，它們是酶和輔基的關系。它使琥珀酸氧化為延胡索酸過程中所產生的FADH2與酶結合，將來自FADH2的兩個電子直接傳遞給酶的Fe3+。盡管琥珀酸脫氫酶的作用是專一的，但丙二酸(與底物結構上很相似)可以與該酶結合，使其不能發揮催化作用脫氫，因此，丙二酸是琥珀酸脫氫酶的強抑制劑。琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸的脫氫具有嚴格的立體專一性。琥珀酸脫氫酶與檸檬酸循環中的其他酶不同，是唯一嵌入到線粒體內膜的酶，是線粒體內膜的一個重要部分，其他酶大多存在于線粒體的基質〔12，13〕。

2NO

NO可與氧自由基、血紅蛋白、超氧自由基反應，在不同位置發揮不同作用。低濃度時，NO可形成亞硝酰基血紅素復合物，促進環磷酸鳥苷形成，進而激活相關蛋白激酶抑制Ca2+內流，促進血管擴張，改善微循環；可通過亞硝酸化減輕鈣超載所致的毒性，減少細胞毒性物質的生成，起到保護作用。然而，高濃度的NO及其衍生物又可抑制DNA的修復與合成，引起核酸的亞硝酰化反應，導致DNA斷裂；可抑制線粒體呼吸鏈產生ATP，造成上皮細胞通透性增加；在心肌細胞中，NO可抑制線粒體呼吸甚至可引起心肌壞死〔14〕。

研究表明，在心肌線粒體中也有較低含量的神經型NO合酶(NOS)(nNOS)存在〔15〕，能夠與Cyt氧化鎂耦聯從而促進NO對心肌線粒體的抑制，位于心肌線粒體內的精氨酸酶可清除NOS底物，其特異性抑制作用可增加nNOS的活性，從而抑制心肌收縮。活化后nNOS在肌漿網通過ryanodine受體刺激鈣內流而增加心肌收縮力。內皮型NOS(eNOS)則可在細胞穴樣凹陷上與β3腎上腺素能受體耦聯，通過L-型鈣通道而抑制β-AR引起的心肌收縮。由此可見，nNOS和eNOS合成NO是在特定部位，與局部產物相關的，在心臟中具有不同的功能。由于肌漿網比細胞膜穴樣凹陷更加靠近線粒體，因此，nNOS介導產生的NOS更容易進入線粒體，影響內皮組織的線粒體。誘導型NOS(iNOS)在正常情況下心肌細胞不表達，但在炎癥、缺氧、再灌注等高損傷時有高表達，高表達的iNOS持續介導高水平NO，從而抑制心肌細胞線粒體呼吸功能來減弱肌肉收縮和氧耗速度。

2.1抑制線粒體呼吸鏈NO對Cyt氧化酶(復合物Ⅳ)具有快速的可逆性抑制作用，同時，所產生的活性氮(RNS)產物可對線粒體呼吸鏈中的多種組分產生緩慢而又不可逆的抑制作用。NO與亞鐵血紅蛋白的高親和力，導致NO與血紅蛋白(Hb)的親和力是一氧化碳(CO)的1 000倍，在血液中能迅速形成亞硝基Hb，納摩爾水平的NO便可快速可逆地抑制復合物Ⅳ，減弱后者與氧的結合能力。這種抑制作用是NO通過與血紅素a3的鐵離子和CuB中的銅離子結合后生成a32+-NO+和CuB-NO+兩種復合物，水合后形成亞硝酸鹽〔16〕。其中NO與鐵離子的結合可在光的作用下逆轉，而與銅離子的結合不可逆轉。此外，NO還可用過對呼吸鏈中的修飾來持續抑制線粒體呼吸，通過硝基化或硫基亞硝基化等方式抑制Cyt-c傳遞電子的功能。NO對線粒體復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的抑制作用緩慢而持續，硝基化或硫基亞硝基化可滅活復合物Ⅰ，復合物Ⅱ中的硫鐵鍵可被高水平的RNS所破壞，復合物Ⅲ的活性可被NO可逆性抑制，但具體機制尚未闡明。

2.2抑制三羧酸循環NO通過硫基亞硝基化產生過亞硝酸鹽，抑制線粒體中的順鳥頭酸酶，進而影響三羧酸循環產生能量〔17〕。NO可通過硫基亞硝基化抑制肌酸激酶生物學功能，從而影響ATP運輸和再生，還可通過可溶性鳥苷酸環化酶-環磷酸鳥苷信號途徑調控過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子(PGC)-1α轉錄，進而調節線粒體生物合成，使得Cyt-c和Cyt-c氧化酶的表達及線粒體數目都顯著增加，而PGC-Ⅰ、RNF-1和mtTFA的表達明顯上調〔18〕。

2.3促進mPTP開放過亞硝酸鹽和亞硝基硫醇可作用于mPTP引起線粒體膜通透性增加，NO本身也可通過抑制線粒體呼吸和降低△φm來促進孔的開放。然而，NO還可通過活化可溶性鳥苷酸環化酶使蛋白激酶G活化，后者可使mPTP的部分蛋白質磷酸化，使得孔的開放頻率降低。調節細胞內鈣濃度及活化線粒體內ROS產物也可間接影響到孔的開放狀態。mPTP過性開放可引起線粒體內膜明顯腫脹，外膜破裂，促凋亡因子如Cyt-c，凋亡誘導因子等釋放并啟動細胞凋亡程序。長時間開放則可引起線粒體膜電位去極化，氧化磷酸化解耦聯，ATP合成障礙，最終導致細胞壞死。

3鈣超載

鈣離子(Ca2+)對于維持細胞的動作電位、神經傳導功能、肌肉伸縮與舒張功能及神經-肌肉傳導功能，具有重要的作用。Ca2+是調控心肌細胞線粒體呼吸功能的重要機制，其濃度的變化可調整線粒體氧化磷酸化功能。

3.1Ca2+在心肌細胞內的調節線粒體攝取Ca2+是通過內膜電位差和Ca2+濃度差實現的，三羧酸循環產生NADH等建立H+濃度差，從而形成膜兩側電位差用于電子鏈傳遞以合成ATP。Ca2+內流減少電位差，從而調節膜兩側電位差，進而調節ATP的合成。Ca2+的外流是通過與Na+交換完成的，這種方式被稱為依賴性外流，在心臟和腦中是主要的外流方式。攝取與外流使Ca2+在心肌細胞線粒體中處于循環狀態，生理狀態下，心肌細胞的肌漿網是胞內參與Ca2+調節最主要的細胞器。當心肌缺血后，細胞游離Ca2+水平的升高一是通過ATP降解造成腺苷釋放而激活蛋白激酶C，導致ATP敏感性鉀通道開放延長，在電壓調節下，Ca2+通道開放延長造成的；二是Na+濃度的升高伴隨著上述反應，Ca2+/Na+交換蛋白的活性受跨膜Na+濃度梯度的調節，從而導致細胞內Ca2+超載。實驗研究發現，休克復蘇后Ca2+明顯升高是再灌注損傷使細胞膜通透性增強，同時也伴隨著Ca2+/Na+交換增強，使心肌合成ATP功能受到影響。大量活性氧產生，細胞內Ca2+水平升高，使再灌注階段的細胞凋亡比單純缺血階段更為顯著〔19〕。缺氧狀態下，在氧化磷酸化功能嚴重受損時，線粒體可能成為調節心肌細胞內Ca2+含量最主要的細胞器。肌漿網攝取鈣離子的能力遠不如線粒體，因此當胞質游離鈣濃度增加時，線粒體攝鈣速度遠大于釋鈣速度，導致線粒體內鈣積聚，但是線粒體鈣積聚的能力并不是無限的，過多的鈣沉積會導致線粒體功能紊亂。

3.2鈣超載損傷心肌細胞的機制鈣超載與氧自由基損傷是引起心肌缺血缺氧損傷的重要發病環節，尤其是在缺血再灌注損傷中，二者的聯系較為密切。大量氧自由基的產生可直接損傷細胞膜從而加速Ca2+內流，又能通過抑制鈣泵活性來抑制胞質鈣濃度降低。Bolli等〔20〕認為再灌注初期，大量氧自由基對組織損傷起主要作用，在隨著損傷的進展及Na+-Ca2+交換，Na+通過缺氧時H+-Na+交換泵出胞內H+，使胞內Na+升高來促進Ca2+交換，導致鈣超載，鈣超載對心肌細胞的功能障礙和壞死發揮主要作用。

到目前為止，人們發現只有在缺氧等病理條件下，線粒體才與Ca2+發生關系，當Ca2+在缺氧心肌內過量涌入并危及心臟功能時，線粒體“開啟”其鈣庫功能；就心肌細胞內線粒體的數量和總體而言，它無疑是心肌細胞內最大的“Ca2+庫”。但Ca2+在線粒體內的儲積，使線粒體消耗大量ATP；同時，線粒體內Ca2+與含磷酸根的化合物形成磷酸鈣，干擾線粒體的氧化磷酸化，使ATP生成減少，引起能量代謝障礙。細胞內Ca2+超載可激活多種磷脂酶，促進膜磷脂分解，損傷生物膜；膜磷脂的降解產物花生四烯酸、溶血磷脂等增多，增加了膜通透性，加重膜的功能紊亂。同時，細胞內鈣超載使Ca2+依賴性蛋白水解酶活性增高，促進黃嘌呤脫氫酶轉變為黃嘌呤氧化酶，使自由基生成增多，損害心肌細胞。

4Δφm降低

線粒體內膜通透性較低，保證了線粒體基質內環境穩定。當電子經過呼吸鏈傳遞過程中，伴隨H+由線粒體基質內通過質子泵泵出到膜間隙，H+在膜間隙積聚，從而建立△φm。△φm是反映細胞線粒體功能狀態的重要參數之一，既能驅動線粒體合成ATP，又能在細胞耗能增加時，促進信號鈣進入線粒體，加速線粒體合成ATP；同時，△φm也是監測線粒體內膜通透性的指標之一。

4.1線粒體△φm降低的機制質子泵學說認為，線粒體內膜外質子通過F0亞基上的質子通道回流產生的勢能為ADP磷酸化提供能量，如果這個機制發生障礙必將使△φm降低。

4.2△φm降低與細胞凋亡的關系△φm消失標志著一個不可逆轉的凋亡過程。有研究表明，△φm消失可引起Cyt-C從線粒體釋放出來，誘導細胞凋亡；同時，△φm下降早于DNA斷裂和磷脂酰絲氨酸(PS)外翻〔21〕，提示△φm下降為凋亡早期階段，通過抑制△φm下降抑制細胞凋亡，說明△φm下降為凋亡的特異性改變。也有研究表明，凋亡細胞PS外翻早于△φm降低及Cyt-C釋放，提示PS外翻可能獨立于線粒體，引起細胞凋亡，尚待進一步研究〔22〕。

5mPTP

mPTP是存在于線粒體內外膜之間的一組蛋白復合體，是一種非特異性通道，其分子組成尚未完全清楚。目前，多數學者〔23〕認為mPTP由外膜的電壓依賴的陰離子通道(VDAC)、內膜的腺嘌呤核苷酸轉位酶(ANT)及親環素(Cyp)D等組成。生理狀態下，mPTP呈周期性開放，對維持線粒體功能有著重要的意義；缺血、缺氧等條件下，mPTP在細胞凋亡的發生過程中扮演著重要角色。

5.1誘導mPTP開放的因素缺血/再灌注后，多種因素可導致mPTP開放，但影響最大的是鈣超載和氧自由基大量生成。Ca2+誘導mPTP開放是通過與其金屬位點和實現的，另外線粒體內的鈣超載可致使ANT構型改變，導致mPTP高水平開放；過氧化物則是通過氧化mPTP上的硫醇，引起mPTP開放。mPTP開放在不同階段由不同因素起主導作用。缺血期，細胞內鈣超載起主導作用；再灌注早期，產生的大量自由基起關鍵作用；再灌注晚期，Bcl-2/Bcl-xL和Bax的比例決定了mPTP開放。也有學者發現在缺血期間，標記的脫氧葡萄糖(DOG)無法進入線粒體基質，再灌注期DOG明顯增多，而推測缺血早期mPTP是關閉的；但可以確定，mPTP開放發生在再灌注期，而且在決定細胞壞死中起關鍵作用〔24〕。

5.2mPTP開放產生的效應當mPTP開放后，一方面引起線粒體內膜通透性增加，使胞質中的大量正離子進入線粒體，進而引起△φm降低，導致部分ATP被用來恢復質子梯度，加重細胞耗能；另一方面降低ATP合成的驅動力，減少ATP合成，引起能量代謝障礙。同時，由于Ca2+在線粒體內不斷積聚，加重鈣超載，從而引起線粒體損傷甚至細胞壞死或凋亡；另外，mPTP開放可導致線粒體基質膨脹引發外膜破裂，促使大量凋亡蛋白和細胞凋亡誘導因子(AIF)釋放，促使細胞壞死。在輕度缺血或僅限部分線粒體mPTP開放時，再灌注后隨著線粒體功能的恢復，細胞死亡是可能避免的。但是，如果線粒體損傷達到一定程度，會使細胞出現不可逆性損傷。因此，mPTP是決定細胞死亡機制的閥門。

6凋亡蛋白

在線粒體膜及膜間隙中存在半胱氨酸基天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase)、Bcl-2蛋白家族、ANT、凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)等可調控和促進細胞凋亡發生的相關蛋白。線粒體介導心肌細胞凋亡的機制與這些蛋白的表達與釋放密切相關。

6.1Caspase的激活與效應Caspase是一類蛋白酶家族，目前有10種不同的Caspase，各種Caspase都富含半胱氨酸。生理條件下，每一種caspase都是以非活性狀態存在的，其肽鏈比有活性時長一些；致病因素作用于細胞，可將多出的部分切除，使其轉變為有活性的Caspase，可切割靶蛋白的特異天冬氨酸殘基，引起凋亡。同時，Cyt-c釋放到胞質后，發生亞硝基化或不發生亞硝基化，與dATP、Apaf-1、procaspase-9聚合成為凋亡體，激活procaspase-9與Caspase-3，從而導致細胞凋亡〔25，26〕。

6.2ANT對線粒體功能的調控ANT位于線粒體內膜，是線粒體基質與胞液轉換ATP與ADP的載體，其活性與線粒體內ATP含量呈協調變化。急性缺氧狀態下，ANT轉運活性下降，表明ATP轉運效率下降；隨著缺氧時間延長，雖然線粒體氧化磷酸化仍處于低水平，但ATP含量部分恢復，可能與ATP消耗和轉化減少有關；進一步延長缺氧時間，線粒體ATP含量和ANT轉運活性進一步下降。

6.3Bax與Bcl-2表達Bax與Bcl-2是同一家族但功能相反的兩組基因，在細胞周期的調控中是通過二者結合后形成的二聚體來發揮作用的，在二聚體中，兩者的比例決定促凋亡特性。當Bcl-2蛋白表達減少或Bax蛋白表達增加時，促使細胞凋亡；當Bcl-2蛋白表達增加或Bax蛋白表達減少時，則抑制細胞凋亡。目前認為Bax與Bcl-2的表達是通過Cyt-c進入線粒體后激活Caspase-3而引起的。

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〔2014-10-19修回〕

(編輯杜娟)

通訊作者：趙自剛(1974-)，男，碩士，教授，碩士生導師，主要從事創傷休克病研究。

基金項目：河北省高校百名創新人才支持計劃(Ⅱ)；河北省人才培養工程資助計劃；河北北方學院創新人才培育基金(CXRC1314)

中圖分類號〔〕R363.2〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0223-05；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.103