黃芪甲苷預處理對無血清及缺氧誘導的骨髓間充質干細胞TNF-α、TGF-β1基因表達的影響

黃　燦，冼紹祥，馬春濤

(1.三亞市中醫院，海南 三亞 572000；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣州 510405)

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黃芪甲苷預處理對無血清及缺氧誘導的骨髓間充質干細胞TNF-α、TGF-β1基因表達的影響

黃燦1，冼紹祥2*，馬春濤1

(1.三亞市中醫院，海南 三亞 572000；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣州 510405)

摘要：目的觀察黃芪甲苷預處理對無血清及缺氧誘導的骨髓間充質干細胞(MSCs)凋亡相關因子的影響，并探討其作用機制。方法采用密度梯度離心法分離培養大鼠MSCs，通過藥物細胞毒性試驗檢測黃芪甲苷對MSCs細胞活性的影響，分別以40、80、160 μg/mL的黃芪甲苷預處理MSCs 24 h，后進行無血清及缺氧培養24 h，RT-PCR法檢測細胞中TNF-α、TGF-β1的基因表達情況。結果密度梯度離心法可有效分離大鼠MSCs；各濃度黃芪甲苷對MSCs細胞活力均無影響；無血清及缺氧誘導可下調TGF-β1的基因表達；160 μg/mL黃芪甲苷組可上調TGF-β1的基因表達。結論無血清及缺氧誘導的MSCs凋亡可能是由于缺氧及生長因子匱乏的刺激所引起的，黃芪甲苷抑制無血清及缺氧誘導的MSCs凋亡的作用可能是通過提高MSCs在缺血缺氧環境下合成生長因子的能力實現的。

關鍵詞：骨髓間充質干細胞；細胞凋亡；黃芪甲苷；生長因子

研究[1]表明，運用干細胞移植替代心肌梗死后缺血凋亡的心肌細胞，促進梗死區域心肌細胞再生及局部毛細血管網及側支循環的形成，可使心功能得到一定程度的改善，從而被美國心臟病學會評為世界心血管領域10大研究進展之一。而MSCs在心肌梗死后的缺血和營養剝奪的病理微環境中生存率較低，大大限制了MSCs對損傷心肌的修復能力[2]。本研究早前已經證實了黃芪甲苷預處理對于無血清及缺氧誘導的MSCs凋亡具有抑制作用[3]，但不清楚其作用機制，因此繼續通過對凋亡相關因子的檢測，來探討黃芪甲苷抑制MSCs凋亡的作用機制。

1材料與方法

1．1 動物SPF級SD大鼠5只,體質量120～150 g,雄性，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。動物合格證號：0099253。

1．2試劑DMEM/F12培養基、胎牛血清、雙抗、0．25%胰酶及胰酶替代物，GIBCO公司；黃芪甲苷，購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110781-200613；Percoll分離液購自GE公司；厭氧產氣袋、氧氣指示劑及密封培養罐購自日本三菱瓦斯化學株式會社；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；Trizol購自美國invitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture(With ROX)購自北京康為世紀科技有限公司；其他試劑，均為國產分析純。

1．3儀器熒光倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；CO2培養箱(美國THERMO公司)；離心機(德國Eppendorf公司)；酶標儀(瑞士TECAN公司，型號：CENios)；Standard 96實時熒光定量PCR儀(美國Life公司，型號：ViiA7)；熱循環儀(杭州晶格科學儀器有限公司，型號：K640)；臺式高通量DNA合成儀(Life公司，型號：3900)；點動試管振蕩器(德國IKA，型號：VORTEX1)。

1．4實驗方法

1．4．1大鼠MSCs分離與培養采用密度梯度離心法分離大鼠MSCs[3]，然后以1×105/cm2接種到培養瓶內，置于37 ℃、5%CO2培養箱中進行培養。72 h之后更換完全培養基，當細胞生長至約80%融合時，用0．25%的胰酶消化細胞，進行傳代培養。

1．4．2CCK法藥物毒性檢測將一定量的生長狀態良好的MSCs消化后制成細胞懸液，以1×104個細胞/孔的密度加入96孔培養板上中間的孔中，每孔100 μL細胞懸液，培養板四周的孔中加入PBS作為空白對照，將培養板置于37 ℃、5%CO2培養箱預培養24 h。分組向各孔加入10 μL以下各組藥物(黃芪甲苷40、80、160 μg/mL；0．16%DMSO工作液)，每組10個孔，另設立未加藥物10個孔作為正常細胞對照孔。將培養板置于培養箱孵育24 h。向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，繼續置于培養箱內孵育1 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度(以OD值表示)。

1．4．3實驗分組及預處理正常對照組:用完全培養基培養，置于37 ℃、5%CO2培養箱中；無血清缺氧組：僅用完全培養基培養；黃芪甲苷組：分別用完全培養基加上40 μg/mL(0．04% DMSO)、80 μg/mL(0．08% DMSO)、160 μg/mL(0．16 % DMSO)黃芪甲苷預處理MSCs；DMSO組：用完全培養基加上最大溶媒濃度(0．16% DMSO)作為溶媒對照組預處理MSCs。除正常對照組外，余各組培養置于37℃、5%CO2培養箱中24 h，后改用無血清及缺氧培養條件模擬心肌梗死后缺血缺氧微環境：用PBS洗滌細胞2次，以去除殘留的培養基，加入無血清DMEM，然后將細胞培養板、厭氧產氣袋及氧氣指示劑快速放入密封培養罐中，培養罐置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h。

1．4．4RT-PCR法檢測TNF-α、TGF-β1的基因表達采用Trizol法提取總RNA，然后按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。內參GAPDH的上游引物序列為5'-CTCCCATTCCTCCACCTTTG-3’，下游引物序列為5’-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’；TNF-α的上游引物序列為5’-CCACGCTCTTCTGTCTACTG-3’，下游引物序列為5’-GCTACGGGCTTGTCACTC-3’;TGF-β1的上游引物序列為5’-ATTCCTGGCGTTACCTTG-3’，下游引物序列為5’-CCCTGTATTCCGTCTCCTT-3’。然后進行PCR反應，反應條件為:95 ℃反應10 min，然后95 ℃反應15 s，60 ℃反應1 min，共40循環。溶解曲線：95 ℃反應15 s，60 ℃反應1 min，95 ℃反應15 s。陰性質控品采用滅菌雙蒸水。反應結束后保存檢測數據文件，分析計算出的樣品Ct值。采用經典2-△△Ct法計算各樣本的相對定量，進行基因表達差異的數據分析。

2結果

2．1大鼠MSCs培養原代細胞接種24 h后部分細胞逐漸貼壁，呈圓形、梭形或多角形等多種形態，培養72 h后換液，可見細胞呈集落式生長，以短梭形、星形細胞為主，后逐漸呈放射狀排列，以梭形細胞為主，7 d后融合80%～90%，呈漩渦狀緊密排列。經傳代后細胞逐漸純化，呈形態均一的長梭形，生長旺盛。

2．2藥物毒性檢測CCK-8試劑盒檢測顯示，細胞經40、80、160 μg/mL L黃芪甲苷及0．16% DMSO培養24 h后，所測得的OD值與正常培養的細胞所測得的OD值比較均無統計學意義(P>0．05)。

2．3RT-PCR法檢測TNF-α、TGF-β1的基因表達見表1。

組 別TNF-αTGF-β1正常對照組1.45±0.305.30±0.25#無血清缺氧組1.001.00溶媒對照組1.35±0.381.27±0.12 40μg/mL黃芪甲苷組1.42±0.460.90±0.22 80μg/mL黃芪甲苷組1.29±0.181.14±0.32 160μg/mL黃芪甲苷組1.25±0.091.46±0.07#

注：與無血清缺氧組比較，#P<0.05

3討論

3．1黃芪甲苷預處理對TNF-α的影響[4]腫瘤壞死因子-alpha(TNF-α) 主要是由活化的單核巨噬細胞分泌的一種多功能的細胞因子，主要介導免疫及炎癥反應。在心肌梗死后壞死心肌局部缺血缺氧的微環境下，可引起細胞內鈣超載以及氧自由基的大量釋放，從而激活TNF-α、白介素-6等炎性因子，導致細胞凋亡的發生。本研究對TNF-α的基因表達進行了檢測，結果顯示各實驗組的TNF-α基因表達水平無統計學意義，這表明無血清及缺氧誘導MSCs凋亡的過程中未引起TNF-α基因的上調，各藥物組對其表達水平亦無影響，說明在無血清及缺氧誘導24 h后出現的MSCs早期凋亡不是由炎癥因子的激活所引起，可能是由其他影響因素所引起的。

3．2黃芪甲苷預處理對TGF-β1的影響[5]TGF-β1廣泛存在于多種生物的各種組織中，具有多重生物學效應，參與細胞生長分化、血管形成、細胞外基質形成等多種生物學過程[6]。不僅是調控MSCs增殖的主要生長因子之一，而且可抑制多種炎性介質的生物活性,同時還是一種強的免疫抑制劑，使同種異體細胞移植更為安全。

本研究通過對TGF-β1基因表達水平的檢測，發現無血清缺氧組MSCs的TGF-β1基因的表達較正常對照組顯著下調,說明在無血清及缺氧培養條件下,MSCs的生長因子的轉錄活性下降，這可能是由于缺氧及血清剝奪導致細胞生長所需的氧氣及營養成分匱乏所造成的,并由此刺激MSCs出現凋亡。實驗結果顯示與無血清缺氧組相比，較高濃度黃芪甲苷組可顯著提高無血清及缺氧培養條件下MSCs的TGF-β1基因表達；低、中濃度黃芪甲苷組及溶媒對照組的TGF-β1基因表達與無血清缺氧組無統計學意義。說明一定濃度的黃芪甲苷可以提高MSCs在缺血缺氧環境下合成生長因子的能力，并可能由此抑制由生長因子匱乏所介導的細胞凋亡。

3．3黃芪甲苷抑制細胞凋亡作用的應用前景現代藥理學研究[7-11]表明，黃芪甲苷具有較好的抗凋亡作用，多項體內外研究通過對過氧化物損傷、病毒損傷、缺氧等不同誘導條件所造成的細胞凋亡的干預實驗，證實了黃芪甲苷具有抑制干細胞、心肌細胞等多種細胞凋亡的作用。由此可見黃芪甲苷對于細胞凋亡的抑制作用為非特異性的，具有較為廣泛的應用范圍。

本研究證實了一定濃度的黃芪甲苷可提高MSCs部分生長因子的表達水平，以此推測其可能是通過改善細胞生長因子的表達來達到抑制細胞凋亡的作用。研究[12-15]認為，MSCs具有旁分泌作用，能夠分泌多種細胞因子，這些因子廣泛參與了減少MSCs及心肌細胞凋亡、促進心肌細胞再生、減少心肌纖維化、促進循環中的MSCs和內皮祖細胞動員和歸巢到心肌梗死部位、增加缺氧心肌區域的新生血管密度、輔助細胞外基質重建等過程。黃芪甲苷可提高MSCs部分生長因子的表達水平，但其是否能夠提高MSCs向微環境分泌生長因子的能力、提高缺血缺氧微環境下生長因子的含量有待進一步通過檢測MSCs所處的培養液中的生長因子含量，以探索黃芪甲苷對細胞微環境的影響，這將極大地擴展其在再生醫學領域的應用前景。

參考文獻：

[1]賈超,王其新.骨髓間充質干細胞移植治療心力衰竭的臨床研究進展[J].中國分子心臟病學雜志,2011,11(1):60-64.

[2]COPLAND I B,LORD-DUFOUR S,CUERQUIS J,et al.Improved autograft survival of mesenchymal stromal cells by plasminogen activator inhibitor 1 inhibition[J].Stem Cells,2009,27(2): 467-477.

[3]黃燦,冼紹祥,沈淑靜.黃芪甲苷預處理抑制無血清及缺氧誘導的MSCs凋亡的研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2013,24(3):213-217.

[4]HASLETT C.Resolution of acute inflammation and the role of apoptosis in the tissue fate of granulocytes[J].Clinical Science(London,England : 979),1992,83(6): 639-648.

[5]BONAVITA F,STEFANELLI C,GIORDANO E,et al.H9c2 cardiac myoblasts undergo apoptosis in a model of ischemia consisting of serum deprivation and hypoxia: inhibition by PMA[J].FEBS Letters,2003,536(1/3):85-91.

[6]BARRON D A,STRAND D W,RESSLER S J,et al.TGF-beta 1 Induces an Age-Dependent Inflammation of Nerve Ganglia and Fibroplasia in the Prostate Gland Stroma of a Novel Transgenic Mouse[J].PLOS One,2010,5(10):e13751.

[7]劉丹莉,楊云華,于小華,等.黃芪甲甙干預小鼠骨髓間充質干細胞凋亡的研究[J].陜西醫學雜志,2010,39(3):259.

[8]羅永姣,鄧暉,李雙杰,等.黃芪甲甙在Balb/C小鼠CVB3病毒性心肌炎中抗凋亡作用的機制[J].南華大學學報(醫學版),2010,38(3):328-331.

[9]桂定坤,陳建國,陳宜方,等.黃芪甲苷抑制高糖誘導的足細胞凋亡作用及機制[J].中華中醫藥學刊,2010,28(4):822-824.

[10]LI L,TAO H-y,CHEN J-b.Antiapoptosis effect of astragaloside on adriamycni induced rats cardiotoxicity[J].Zhongguo Zhong xi yi jie He za zhi,2006,26(11): 1011-1024.

[11]ZHANG Z-c,LI S-j,YANG Y-z,et al.Effect of astragaloside on cardiomyocyte apoptosis in murine coxsackievirus B-3 myocarditis[J].Journal of Asian Natural Products Research,2007,9(2): 145-151.

[12]LI Li-li,ZHANG Shuo,ZHANG Yao,et al.Paracrine action mediate the antifibrotic effect of transplanted mesenchymal stem cells in a rat model of global heart failure[J].Molecular Biology Reports,2009,36(4): 725-731.

[13]ANGOULVANT D,IVANES F,FERRERA R,et al.Mesenchymal stem cell conditioned media attenuates in vitro and ex vivo myocardial reperfusion injury[J].Journal of Heart and Lung Transplantation,2011,30(1): 95-102.

[14]FAISAL S,JOZEF B,MARC V.Adult stem cells in the treatment of acute myocardial infarction[J].Catheterization and Cardiovascular Interventions : Official Journal of the Society for Cardiac Angiography & Interventions,2011,77(1): 72-83.

[15]BOOMSMA R A,GEENEN D L.Mesenchymal stem cells secrete multiple cytokines that promote angiogenesis and have contrasting effects on chemotaxis and apoptosis[J].PLOS One,2012,7(4): e35685.

Astragaloside pretreatment on gene expression of TNF-α and TGF-β1 with serum-free and hypoxia-induced MSCs

HUANG Can1,XIAN Shaoxiang2*,MA Chuntao1

(1.Sanya Hospital of Traditional Chinese Medicine,Sanya 572000,Hainan Province,China;2.The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405,China)

Abstract：ObjectiveTo explore the effect and mechanism of Astragaloside on bone mesenchymal stem cells (MSCs) apoptosis induced by serum-free and hypoxia.MethodsDensity gradient centrifugation method was used to isolate and cultivate rat MSCs.Toxicity tests was used to detect the cytoactive of MSCs affected by Astragaloside.MSCs were pretreated by Astragaloside with 40 μg/mL,80 μg/mL,60 μg/mL respectively in 24 ,then cultivated in serum-free and hypoxia in 24 h.RT-PCR was used to detected the gene expression of TGF-β1 and TNF-α.ResultsMSCs were isolated effectively by using density gradient centrifugation.Astragaloside had no toxicity on MSCs viability.The induction by serum-free and hypoxia could decrease the expression of TGF-β1.The Astragaloside could increase the expression of TGF-β1.ConclusionThe apoptosis of MSCs induced by serum-free and hypoxia may be result from the absence of oxygen and growth factor.Astragaloside could inhibit MSCs apoptosis induced by serum-free and hypoxia.The possible mechanism may be Astragaloside could promote the composition of growth factor.

Keywords：bone marrow mesenchymal stem cells;poptosis;stragaloside;growth factor

(收稿日期:2015-08-28)

文章編號：2095-6258(2016)01-0025-03

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

*通信作者：冼紹祥，電話-(0898)88275345，電子信箱-21533303@qq.com

作者簡介：黃燦(1985-)，女，博士研究生，主治醫師，主要從事中醫藥防治心血管疾病。

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81173438)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.01.008