HGF/c-Met信號通路在克唑替尼誘導不同肺癌細胞株凋亡中的作用*

呂金益，　董芷辛，　李婭妮 ，　寧瑞玲，　宋向群，　周韶璋△

(廣西醫科大學 1附屬腫瘤醫院， 2研究生院，廣西 南寧 530021)

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HGF/c-Met信號通路在克唑替尼誘導不同肺癌細胞株凋亡中的作用*

呂金益1，董芷辛1，李婭妮1，寧瑞玲2，宋向群2，周韶璋2△

(廣西醫科大學1附屬腫瘤醫院，2研究生院，廣西 南寧 530021)

[摘要]目的： 觀察克唑替尼(crizotinib)誘導不同肺癌細胞株凋亡中HGF/c-Met信號通路的變化并探討其調控機制。方法：采用噻唑藍(MTT)法檢測克唑替尼對H1993(c-Met擴增的肺腺癌細胞)、H2228(含有EML4-ALK融合基因的肺癌細胞)和A549細胞的活力抑制情況；采用流式細胞術檢測3種細胞在克唑替尼作用后24 h、48 h和72 h的凋亡率；采用Western blot檢測細胞在克唑替尼作用前后HGF/c-Met信號通路中MET蛋白及其磷酸化形式p-MET的水平，同時觀察其下游通路關鍵蛋白AKT、ERK、p-AKT和p-ERK的變化情況。結果：MTT結果表明克唑替尼作用72 h后，H1993、H2228和A549細胞株的細胞活力抑制率均呈劑量依賴性升高。流式細胞術檢測發現隨著克唑替尼作用時間的延長，細胞凋亡率呈時間依賴性增加(P<0.05)。Western blot檢測結果提示在H1993細胞株和H2228細胞株中，p-MET、p-AKT和p-ERK隨著時間的延長蛋白水平呈現下降趨勢。而在A549細胞株中p-AKT、p-ERK和p-MET在藥物作用72 h后的變化趨勢不明顯。結論：初步證實HGF/c-Met信號通路與克唑替尼誘導肺癌細胞株H1993和H2228凋亡相關。

[關鍵詞]HGF/c-Met信號通路; H1993細胞; H2228細胞; 克唑替尼; 細胞凋亡

近十年來，基于分子靶點的個體化治療在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)研究中取得了重大進展，尤其是以表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)和間變淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)為靶點藥物的發現，對NSCLC個體化治療的發展具有里程碑式的意義，分子靶向治療也成為越來越重要的研究方向。

克唑替尼(crizotinib)為針對ALK/c-Met雙靶點的酪氨酸激酶抑制劑，主要用于治療存在EML4-ALK融合基因的晚期NSCLC患者，且已取得顯著療效[1]。c-Met是一類原癌基因，其蛋白產物是肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)的受體，并具有酪氨酸激酶的活性，在與受體進行特異結合后可激活一系列的跨膜信號通路[2]，從而促使上皮細胞出現增生、遷移等[3]。阻斷HGF/c-Met系統的配對表達或信號轉導可作為抗腫瘤侵襲和轉移的治療策略之一，因為阻斷作用不僅能夠抑制腫瘤生長，還能抑制腫瘤轉移[4]。HGF及其c-Met受體因在NSCLC中的發生、發展及EGFR-TKI耐藥中均有非常重要的作用[5-6]，而成為NSCLC靶向治療領域研究的一個重要方向。我們的研究通過克唑替尼作用在MET擴增的肺癌細胞系H1993細胞和EML4-ALK陽性的肺癌細胞系H2228細胞，觀察克唑替尼誘導的細胞凋亡情況和HGF/c-Met通路及其下游信號的變化。

材料和方法

1實驗材料

1.1細胞人非小細胞肺癌細胞H2228和H1993購自ATCC；人非小細胞肺癌細胞A549由廣西醫科大學腫瘤醫學院實驗部提供。

1.2主要試劑與儀器克唑替尼粉末制劑購于CST；RPMI-1640 培養基、胎牛血清和胰酶替代物購自Gibco；MTT 購自Amresco；Annexin V-PE/7AAD 細胞凋亡檢測試劑盒購自BD；MET I 抗、p-MET I 抗、AKT I 抗、p-AKT I 抗、ERK I 抗和p-ERK I 抗均購自CST；BCA 試劑盒購自Merck。Western blot 儀器設備購于Bio-Rad。

2方法

2.1細胞培養按腫瘤貼壁細胞的常規培養方法培養H1993細胞、H2228細胞與A549細胞至良好狀態。

2.2MTT法檢測細胞活力按培養H1993細胞、H2228細胞和A549細胞至對數生長期，按(2～6)×103cells/well的密度接種于96孔板，預設置6個濃度，每個濃度設置4個復孔，置于細胞培養箱中培養24 h后，按濃度梯度加入藥物，把細胞置于培養箱中繼續培養72 h后，吸凈孔內液體，加入MTT繼續培養4 h后再加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，充分振蕩10 min，在492 nm波長下測量吸光度，分別計算出克唑替尼對H1993細胞、H2228細胞和A549細胞的IC50，實驗重復3次。

2.3流式細胞術檢測細胞凋亡和周期分布情況取生長狀態良好的對數生長期H1993細胞、H2228細胞和A549細胞，以每孔4×105、6×105、8×105個細胞數量分別接種于6孔板中，培養24 h，其中H1993細胞加入克唑替尼濃度為200 nmol/L，H2228細胞加入300 nmol/L血清培養液，將按每孔4×105個接種的細胞培養72 h、按每孔6×105個接種的細胞培養48 h、按每孔8×105個接種的細胞培養24 h，以細胞凋亡試劑盒說明書收集細胞并染色后用流式細胞儀測定細胞凋亡率，實驗重復3次。

2.4Western blot檢測克唑替尼對MET/AKT/ERK信號通路相關信號蛋白表達的影響收集長滿瓶的H1993細胞、H2228細胞和A549細胞，用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，所得總蛋白經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上。MET I 抗稀釋度1∶1 000，p-MET I 抗稀釋度1∶1 000，AKT I 抗稀釋度1∶2 000，p-AKT I 抗稀釋度1∶1 500，ERK I 抗稀釋度1∶1 000，p-ERK I 抗稀釋度 1∶1 500，兔、鼠 II 抗稀釋度1∶2 000，以β-肌動蛋白(β-actin)為內參照。ECL發光底物顯色，掃描分析條帶，以條帶灰度確定蛋白表達，實驗重復3次。

3統計學處理

實驗結果采用SPSS 16.0統計軟件進行分析。各組計量資料數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組數據比較采用單因素方差分析，各組均數間的兩兩比較采用SNK-q檢驗和LSD法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1MTT比色法檢測克唑替尼對H1993細胞、H2228細胞和A549細胞株生長的影響

MTT實驗計算得出克唑替尼對H1993細胞的IC50為179 nmol/L，對H2228細胞的IC50為335 nmol/L。A549細胞對克唑替尼的處理不敏感，給予10倍H2228細胞的藥物劑量未能求出IC50。H1993細胞、H2228細胞和A549細胞的增殖抑制率都隨著克唑替尼藥物濃度的升高相應增加，且呈劑量依賴性,見圖1。

2流式細胞術檢測細胞凋亡及周期分布

根據MTT所得IC50作為藥物濃度，3組細胞未經過處理時凋亡率無顯著差異，H1993細胞經克唑替尼作用24 h、48 h和72 h的凋亡率分別為(15.3±2.1)%、(27.2±1.6)%和46.5±1.8)%;H2228細胞經克唑替尼作用24 h、48 h和72 h的凋亡率為(13.7±0.8)%、(25.3±1.6)%和43.5±3.2)%;A549細胞經克唑替尼作用72 h的凋亡率為(15.64±0.61)%。藥物作用后的H1993細胞和H2228細胞凋亡率較A549細胞和未加藥處理組明顯增加(P<0.05)，且隨時間延長凋亡率增加，表明H1993細胞和H2228細胞相對于A549細胞來說對克唑替尼更為敏感，見圖2。

Figure 1.Crizotinib inhibited the viability of 3 cell lines of NSCLC. H1993, H2228 and A549 cells were treated with crizotinib at different concentrations (200 nmol/L and 300 nmol/L) for 72 h. The inhibitory rates were determined by the MTT assay. Mean±SD.n=3.

圖1不同濃度的克唑替尼分別處理3種細胞72 h后的細胞活力抑制率

Figure 2.The apoptosis rates of the H1993, H2228 and A549 cells after treated with crizotinib at different time points. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA549.

圖2經克唑替尼處理H1993、H2228和A549細胞后不同時點的細胞凋亡率

3Western blot檢測克唑替尼對MET信號通路相關信號蛋白表達的影響

檢測克唑替尼誘導H1993、H2228和A549細胞株凋亡中的蛋白變化。200 nmol/L克唑替尼處理c-Met擴增的H1993細胞，300 nmol/L 克唑替尼處理EML4-ALK陽性肺腺癌細胞株H2228細胞。在H1993細胞株中我們發現，經克唑替尼處理72 h后，MET總蛋白表達較未處理組降低，且其下游信號分子p-AKT、p-ERK和p-MET的蛋白水平在藥物作用24 h后明顯降低，并隨時間延長不斷下降，在72 h處p-MET的蛋白水平在三者之中最低。在H2228細胞株中，MET、AKT和ERK總蛋白表達無明顯變化，但其下游信號分子p-AKT、p-ERK和p-MET的蛋白水平在藥物作用48 h后有明顯下降的趨勢，在72 h時水平最低。而在相對不敏感肺癌細胞株A549中MET總蛋白及其下游信號分子p-AKT、p-ERK和p-MET在藥物作用72 h后的蛋白水平變化趨勢不明顯,見圖3。

Figure 3.The protein levels in the 3 cell lines treated with crizotinib at different time points (24 h, 48 h and 72 h) determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group (0 h).

圖3經克唑替尼處理后的H1993、H2228和A549細胞在不同時點的蛋白檢測結果

討論

c-Met為原癌基因，是MET蛋白的編碼基因。MET蛋白的配體為肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)，正常的HGF/c-Met通路能調節胚胎發育及組織損傷修復，而異常的信號激活可促進細胞增殖、減少凋亡，同時使血管生成增多，腫瘤侵襲和轉移行為增加[7]。c-Met與HGF結合引起c-Met胞質內酪氨酸殘基的自身磷酸化，從而進一步激活下游幾個重要的通路：PI3K-AKT信號通路、RAS-MAPK信號通路和STAT3通路[8]。在肺癌中，c-Met往往呈現出高表達的狀態,而且提示與腫瘤的惡性程度有關[9]。克唑替尼為針對ALK/c-Met雙靶點的酪氨酸激酶抑制劑，其作用于c-Met的機制主要是通過抑制c-Met激酶與ATP結合及兩者結合之后的自身磷酸化而發揮作用。Zou等[10]通過細胞實驗發現MET抑制劑克唑替尼能誘導細胞凋亡、減少細胞增殖及抑制血管生成； Okamoto等[11]應用克唑替尼對c-Met陽性與陰性的胃癌細胞進行研究，結果顯示在c-Met陽性的胃癌細胞中c-Met信號通路AKT蛋白一同受到抑制進而誘導胃癌細胞的凋亡，而在c-Met陰性的胃癌細胞中卻未觀察到這一現象。鄭時玉等[12]在乳頭狀甲狀腺癌細胞實驗中采用RNA干擾技術使c-Met沉默后發現腫瘤細胞的克隆形成、周期、遷移、侵襲能力都受到抑制。本研究中亦發現在使用克唑替尼作用c-Met擴增的H1993細胞和EML4-ALK陽性細胞株H2228時,其細胞抑制百分率呈濃度依賴性，細胞凋亡率隨時間的延長而增加，兩者相對于A549細胞和不加藥對照組的凋亡率差異明顯。這與以上學者研究結果相一致。在本研究中我們還發現c-Met水平的下降，可以推測克唑替尼是通過抑制MET蛋白來誘導細胞凋亡。另外，Ou等[13]報道1例存在c-Met擴增而非ALK融合基因的NSCLC患者使用克唑替尼后獲得快速持續的緩解，提示克唑替尼在臨床上可能作為一種c-Met抑制劑，但仍需要進一步研究。

AKT是PI3K/AKT/mTOR信號通路的關鍵分子，能激活下游底物mTOR及其下游p7056K、4E-BP1等信號因子，還能夠通過磷酸化Bcl-2、Fox家族蛋白等來抑制細胞凋亡。ERK通路是目前研究較為深入的MAPK通路，ERK被酪氨酸激酶激活成p-ERK后進入細胞核，促進轉錄因子NF-κB、c-Myc等的磷酸化，促進細胞增殖及對藥物誘導后的抗凋亡作用[14-15]。p-AKT及p-ERK是HGF/c-Met信號通路活化的主要標志，因此在本研究中我們采用Wes-tern blot的方法對MET蛋白和下游的AKT、ERK及其活化形式的信號蛋白進行檢測，實驗結果顯示H1993細胞和H2228細胞在克唑替尼的作用下，MET、AKT和ERK蛋白的活化形式p-MET和p-AKT和p-ERK的蛋白水平隨著時間的推移，均有不同程度下調，在72 h達到最低點。H1993細胞發生下調的時點早于H2228的下調時點，這可能與H1993細胞的c-Met擴增特性相關。而陰性對照A549細胞的MET、AKT和ERK總蛋白及其活化的p-MET、p-AKT和p-ERK蛋白均無明顯受抑制作用，推測在本研究中，克唑替尼能通過抑制c-Met的活化形式p-MET來下調p-AKT和p-ERK磷酸化水平，從而抑制AKT和ERK通路促進細胞存活、抵抗凋亡的作用，促進腫瘤細胞的凋亡。這個研究結果也與Tanizaki等[16]和Kogita等[17]的實驗結果相一致。

與此同時，在實驗過程中我們也觀察到，在藥物作用72 h后，p-Met的表達基本被完全抑制，而其下游的信號蛋白p-AKT和p-ERK并未完全被抑制，我們推測在HGF/c-Met信號通路中可能還有其它的通路參與AKT、ERK信號通路的激活。已經有研究證實[18]c-Met可以通過p53信號通路抑制肺癌細胞的凋亡。Belalcazar等[19]研究發現c-Met信號通路與EGFR和HER3部分下游信號通路相通，存在“cross-talk”現象。Breindel等[20]也發現EGFR信號可以誘導MET的磷酸化， EGFR-MET的“cross-talk”現象不是直接發生的，而是由MET水平和中介信號通過ERK聯合發生。在EGFR野生型或突變的非小細胞肺癌細胞中，抑制EGFR或ERK的信號通路可以減少MET的活化和蛋白水平表達。不過，具體是哪些信號通路或其它轉錄因子參與其中還有待更進一步的實驗來證實。綜上所述，我們可以認為HGF/c-Met通路在調控腫瘤細胞的生長方面有重要作用。

我們的研究為克唑替尼作為MET靶點的抑制劑在臨床上的應用提供了證據。但由于克唑替尼誘導細胞凋亡機制復雜，不清楚的地方仍有很多。進一步研究HGF/c-Met信號的下游通路BIM和survivin，或對HGF/c-Met信號通路關鍵基因進行敲除，檢測HGF/c-Met信號通路上各關鍵蛋白的表達水平和活化水平，明確通路上各蛋白之間的關系，可望更好闡明HGF/c-Met信號通路在肺癌細胞系凋亡中所起的作用。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

阻斷BMK1通路可通過調控BNIP3和BNIP3L抑制腫瘤干細胞

腫瘤干細胞(CSCs)具有干細胞相關的許多特性，并被認為可操控腫瘤的發生。盡管靶向CSCs具有開發新藥物的巨大潛力，但由于目前缺乏有效的藥物靶點和合適的藥理學制劑，其發展仍有很大障礙。Song等的研究結果表明，BMK1的磷酸化不僅與胚胎干細胞和誘導性多能干細胞有關，也與CSCs有關。通過表達MEK5D激活BMK1，可增強CSCs的自我更新(微球體形成實驗證實之)、增殖(克隆形成實驗證實之)和成瘤能力，而BMK1抑制劑XMD8-92能抑制上述過程。RNA測序和微陣列分析結果表明，抑制BMK1顯著增強了細胞死亡過程中的重要蛋白BNIP3和BNIP3L的表達。用shRNA沉默BNIP3和BNIP3L削弱了BMK1抑制劑XMD-8-92對CSCs微球體形成和克隆形成能力的抑制作用。以上結果說明BMK1對維持CSCs的“干性”起到關鍵性作用，提示BMK1有可能成為針對CSCs的藥物靶標。

Oncotarget, 2015, 6(32):33279-33289(黃雪)

Role of HGF/c-Met signaling pathway in crizotinib-induced apoptosis of different lung carcinoma cell lines

Lü Jin-yi1, DONG Zhi-xin1, LI Ya-ni1, NING Rui-ling2, SONG Xiang-qun2, ZHOU Shao-zhang2

(1AffiliatedTumorHospital,2PostgraduateCollege,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China.E-mail:zhoushaozhang@qq.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of HGF/c-Met signaling pathway in crizotinib-induced apoptosis of different lung carcinoma cell lines and to analyze its potential regulatory mechanisms. METHODS: EML4-ALK positive cell line H2228, c-Met proliferation cell line H1993 and control cell line A549 were treated with crizotinib at different doses for different time periods. The viability of the cell lines was measured by MTT assay. The apoptosis was analyzed by flow cytometry with PI staining. The protein levels of MET and phosphorylated MET (p-MET) of HGF/c-Met signaling pathway as well as its down-stream key proteins AKT, ERK, p-AKT and p-ERK in the cell lines before and after crizotinib treatment were examined by Western blot. RESULTS: The growth of H1993, H2228 and A549 cell lines was inhibited after crizoti-nib treatment for 72 h in a dose-dependent manner. Apoptotic rates of H1993 cells and H2228 cells were increased with the crizotinib concentration and exposure time. Down-regulation of p-MET, p-AKT and p-ERK at protein levels in H1993 cells and H2228 cells after exposure to crizotinib for 72 h was confirmed by Western blot. No obvious change of the related-proteins of HGF/c-Met signaling pathway was found in A549 cell line. CONCLUSION: HGF/c-Met signaling pathway may contribute to crizotinib-induced apoptosis of H1993 cells and H2228 cells, which provides the experimental basis for MET-targeting treatment of lung cancer.

[KEY WORDS]HGF/c-Met signaling pathway; H1993 cells; H2228 cells; Crizotinib; Apoptosis

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.010

[中圖分類號]R730.23

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel： 0771-5334955; E-mail: zhoushaozhang@qq.com

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No.81260357; No.81060188)

[收稿日期]2015- 11- 04[修回日期] 2015- 12- 23

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0445- 06

雜志網址： http://www.cjpp.net