POLD3在胃腺癌中的表達及臨床意義分析

陸茵茵，王　超，吳雪銘，黃小英，姚金光，夏　強，馬　韻，龍喜帶，▲

(1.廣西醫科大學附屬第一醫院病理科，南寧 530021；2.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院

病理科，南寧 530021；3.右江民族醫學院附屬醫院病理科，百色 533000；

4.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院肝臟外科，上海 200127)

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論著

POLD3在胃腺癌中的表達及臨床意義分析

陸茵茵1，2，王超3，吳雪銘3，黃小英3，姚金光3，夏強4，馬韻1,2▲，龍喜帶3，4▲

(1.廣西醫科大學附屬第一醫院病理科，南寧 530021；2.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院

病理科，南寧 530021；3.右江民族醫學院附屬醫院病理科，百色 533000；

4.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院肝臟外科，上海 200127)

【摘要】目的探討DNA聚合酶δ 3(eukaryote DNA polymerase δ 3，POLD3)在胃腺癌(gastric adenocarcinoma，GA)中的表達情況及臨床意義。方法收集進行了根治性切除的GA患者82例，并收集相應手術切除標本。通過免疫組織化學、蛋白印跡、體外細胞學、實時定量PCR等技術檢測GA組織與細胞株中POLD3的表達，分析POLD3表達對GA增殖、分化及預后等的影響。結果①與腫瘤旁組織相比，POLD3在GA腫瘤組織中的核酸及蛋白表達水平均明顯下調(P<0.01)，體外細胞學實驗有類似結果；②低POLD3表達水平促進腫瘤去分化及增殖；③POLD3表達水平影響GA患者的預后，高表達和低表達對應的中位總體生存期分別為34個月和16個月(P<0.01),低POLD3表達者其總體死亡風險為高表達者的2.43倍(95%可信區間為1.25～4.71)。結論POLD3在GA腫瘤中表達下調，這種下調與腫瘤的增殖、分化及預后相關。

【關鍵詞】POLD3；胃腺癌；表達；臨床意義

在我國，胃腺癌(gastric adenocarcinoma，GA)是一種常見的嚴重危害生命健康的惡性腫瘤，是第三位癌癥相關性致死原因[1]。由于國內大多數GA患者確診時病程已處于進展期，且多數合并有局部或遠處轉移，故而5年存活率僅為20%左右。因此，尋求早期診斷和判斷預后的標志物依然是該研究領域的重要科學問題[1]。而DNA聚合酶δ 3(DNA polymerase δ 3，POLD3)是一種重要的DNA修復功能基因，在染色體復制過程中扮演重要角色，研究已證明POLD3表達紊亂影響基因組的結構穩定性，并參與結腸癌等腫瘤的發生與發展[2～5]，但POLD3在GA中的表達及臨床意義如何，至今未見報道。

1材料與方法

1.1研究對象與生存隨訪本研究開展前獲得了醫院倫理委員會的關于同意開展本研究的相關倫理審批。研究對象的入選標準為：病理診斷確認的GA患者、TNM分期屬于Ⅰ～Ⅱ期、接受了根治性手術切除、術前無放療與化療史、具有完整臨床病理及生存隨訪資料、知情并同意參與；排除標準為：未經病理確診、TNM分期在Ⅲ期以上、未進行根治性治療、術前具有放療與化療史、臨床病理及生存隨訪資料不全者、不同意參與者。根據以上標準，本研究共入選82例GA患者，所有研究對象均為2005年1月～2008年12月期間在右江民族醫學院附屬醫院住院治療的GA患者，其中男58例(70.7%)，女24例(29.3%)，平均年齡(53.17±11.19)歲，有抽煙或酗酒史者分別為58.5%(48/82)和56.1%(46/82)。腫瘤局限于黏膜層與黏膜下層者(即早期胃癌)4例(4.9%)、達到肌層及以外者(即進展期胃癌)78例(95.1%)，這些腫瘤患者中，高分化者占65.9%(54/82)，而低分化或未分化者占34.1%(28/82)。收集所有患者外科手術切除標本(含腫瘤組織與腫瘤旁組織)用于POLD3的免疫組織化學分析；此外，為分析POLD3的mRNA表達水平，我們也收集了10例新鮮標本。同時，收集所有研究對象的相關臨床病理資料，包括性別、年齡、民族、吸煙史、飲酒史及腫瘤病理特征等。在本研究中，我們定義連續或累積吸煙6個月及以上者為陽性吸煙者，連續或累積酗酒3個月及以上者為陽性酗酒者。此外，我們也對所有病例進行了生存隨訪，隨訪截止日期為2014年12月，我們定義總體生存時間為根治性手術治療后至患者死亡或至隨訪截止日期仍存活所經歷的時間。

1.2細胞與細胞培養胃腺癌細胞株(包括高分化癌細胞株MKN-28和低分化癌細胞株MKN-45)和非腫瘤胃黏膜細胞株GES-1均購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫，細胞培養于含10%胎牛血清和1%青鏈素的DMEM培養基中，于37℃、5%CO2的條件下培養。

1.3POLD3表達載體的構建采用PCR技術結合雙酶切技術以pcDNA3.0為載體構建POLD3表達載體，具體方法參見我們以前的報道[6]。

1.4POLD3蛋白表達水平的檢測采用免疫組化SABC法檢測GA腫瘤組織及腫瘤旁組織中的POLD3蛋白表達水平，表達水平通過陽性細胞數與強度的乘積(即IRS評分法)確定，更為詳細的方法與評分參見我們以前的報道[7]。在當前研究，為便于分析，我們定義IRS≤3分為低POLD3表達，>3分為高POLD3表達。POLD3蛋白在細胞株中的表達則通過蛋白印跡法進行檢測，具體方法參見我們以前的報道[8]。

1.5POLD3核酸表達水平的檢測通過Life公司生產的PureLink?RNA Mini Kit(產品編號：12183018A)和High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(產品編號：4368814)來抽提組織及細胞總RNA和合成cDNA，使用SYBGreen染料法實時定量PCR技術來檢測POLD3 mRNA在組織或細胞株中的表達水平，以β-ACT為內參，POLD3引物為：5’-GTCTA CGAGA GTGAA TCCTG CACA-3’和5’-GGAAC TCCAA CCAAC ACCAG AA-3’，β-ACT引物為：5’-ATGGA TGATG ATATC GCCGC GC-3’和5’-ATCCA CACGG AGTAC TTGCG CTCA-3’。25 μL PCR反應體系含1×UltraSYBR Mixture(產品編號：CW2601，康維世紀)、200 nM引物，以及約50 ng的逆轉錄產物，PCR反應條件如下：95℃預變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火70 s，重復50個循環。所有樣本定量實驗重復三次，取平均值為最終值，采用2-ΔΔCT進行線性化后分析POLD3的相對表達水平。

1.6細胞增殖分析取1000個對數期細胞種植于96孔培養板，經培養細胞分裂達60%培養板面積時，通過LipofectamineTM2000按標準流程將POLD3表達載體、空載或生理鹽水轉染細胞株，在轉染后第1～4天，使用CCK-8增殖檢測試劑盒(產品編號：CK04, DojindoCorp)檢測分析細胞的OD250值，所有試驗重復3次，取平均值用于計算增殖指數(proliferation index, PI)，增殖指數按如下公式計算：PI=OD250Time/OD250Ref，其中OD250Time為檢測時間點的OD250值，OD250Reg為轉染第一天的OD250值[9]。

1.7統計學方法用SPSS 18.0統計軟件進行統計學處理，組間差異采用t檢驗、單因素方差分析來分析，采用Spearman等級相關評價POLD3表達與腫瘤分化的相關性，通過Kaplan-Meier法繪制生存曲線與計算中位生存期(median survival time, MST)，使用多因素Cox風險比例回歸模型分析與計算相關變量的風險值(hazard ratio, HR)和95%的可信區間，在該模型中，我們采用退步法并結合Likelihood Ratio檢驗法篩選變量是否納入模型，檢驗水準：α=0.05。

2結果

2.1POLD3在GA中表達下調免疫組化分析結果顯示：在GA腫瘤組織中，POLD3蛋白表達水平比腫瘤旁組織明顯減少(P<0.01，圖1A)，代表性免疫組化染色圖顯示了這種差異(圖1B)，這種差異性的POLD3表達在mRNA也存在(圖1C)。體外細胞學分析亦有類似的發現(圖1D和E)。

2.2POLD3表達與GA預后相關Kaplan-Meier生存分析表明：與低POLD3表達者相比，腫瘤組織中高POLD3表達的GA患者具有更長的MST，分別為16個月和34個月(P<0.01，圖2)；采用多因素Cox回歸模型經其他風險因素如腫瘤分型、分期等的校正后，低POLD3表達者的死亡風險是高表達者的2.43倍(95%可信區間為1.25～4.71)。

2.3POLD3表達與GA腫瘤分化相關體外細胞學分析結果顯示：與高分化的胃癌細胞株MKN-28相比，低分化的胃癌細胞株MKN-45其POLD3蛋白與核酸表達水平均更低(圖1D和E)，提示POLD3表達水平與GA腫瘤分化程度相關。GA臨床樣本的Spearman等級相關分析進一步證實POLD3表達水平與腫瘤分化程度呈正相關(相關系數為0.331，P=0.01)。

A:POLD3蛋白IRS值的箱圖;B:代表性免疫組織化學染色圖,左為腫瘤旁組織,右為腫瘤組織;C:新鮮GA組織中POLD3mRNA的表達;D:GA細胞株中POLD3mRNA的表達;E:GA細胞株中POLD3蛋白的表達。圖1 POLD3在GA組織和細胞株中的表達情況

圖2 POLD3表達與GA預后

2.4POLD3表達與GA增殖相關體外細胞學實驗表明：具有低POLD3表達的MKN-45細胞株在POLD3過表達的條件下，其增殖能力明顯受到抑制(表1和圖3A)；GA臨床樣本分析也發現大腫瘤具有更低的POLD3表達(圖3B)。

表1　POLD3表達與GA增殖比較

注：表中F值和P值為單因素方差分析結果。

A:MKN-45細胞株中POLD3過表達對MKN-45細胞增殖的影響,圖中條帶為轉染1天后蛋白印跡結果,*和**分別代表P<0.05和0.01;B:GA組織樣本中POLD3表達與腫瘤直徑的關系。圖3 POLD3表達與GA增殖

3討論

GA是一種常見的惡性腫瘤，其發生機制的研究進展緩慢，可用于早期診斷與判斷預后的可信標志物依然處于艱難的探索中[1，10]。我們當前的研究顯示POLD3在GA中表達紊亂，并影響GA的臨床病理特征如腫瘤分化、增殖等，也許是一種有價值的研究與治療靶點。

POL δ是DNA聚合酶B族中的重要成員，包含p125、p50、p66和p12四個亞基；在功能上，主要通過與增殖細胞核抗原的相互調節作用而涉及DNA錯配修復及堿基切除修復等過程[11]。其中p66由POLD3基因編碼，因其充當POL δ與增殖細胞核抗原發生交互作用的直接功能結合域，因此，POLD3對于POL δ是十分必要的，它不僅能提高POL δ與增殖細胞核抗原的親和力，而且能增加POL δ復合體的穩定性[12]。研究表明：POLD3的表達紊亂不僅影響機體DNA錯配修復及堿基切除修復的能力，而且與一些疾病的發生發展相關[2～5]。如Dunlop等[3]通過一個大樣本病例-對照研究分析了POLD3的突變體與大腸癌的關系，結果顯示POLD3突變體增加大腸癌的發病風險，但他們并沒有能分析POLD3在腫瘤組織中的表達情況及意義。我們的研究結果顯示，POLD3在GA腫瘤組織中存在表達紊亂，與非腫瘤組織或細胞相比，腫瘤組織和腫瘤細胞的POLD3核酸與蛋白水平均存在明顯的下調；體外細胞學實驗與GA臨床樣本分析均證實這種下調的POLD3表達影響腫瘤的增殖及分化，起到了類似癌基因的作用。而且，我們的研究也發現GA腫瘤組織中的POLD3表達下調與GA不良預后相關，增加死亡風險約1.4倍，這些結果提示POLD3表達紊亂也許涉及了腫瘤如胃癌的演進，是一個有待深入研究的、也許具有重要價值的潛在腫瘤標志物或治療靶點。

總之，我們當前的研究提示POLD3在GA中表達下調，這種表達下調影響GA腫瘤生物學行為和預后，涉及GA的演進。但是，我們當前的研究僅僅包括了82例符合要求的GA樣本，主要為進展期GA，也許存在一定的選擇性偏倚；同時，由于樣本大小的限制，基于臨床病理特征的生存分層分析未能進行；盡管對POLD3表達紊亂與GA生物學行為如增殖、分化等進行了初步的探討，但并未涉及細胞凋亡、細胞周期等的分析，基于一個大樣本并結合體內外實驗的研究與分析將有助于增加本研究結果的可信度與科學性。

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(編輯：潘明志)

An analysis of POLD3 expression in the gastric adenocarcinoma and its clinical significance

LUYinyin1，2，WANGChao3,WUXueming3,HUANGXiaoying3,YAOJinguang3,XIAQiang4,MAYun1,2▲,LONGXidai3，4▲

(1.DepartmentofPathology,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;2.DepartmentofPathology,CancerHospitalAffiliatedtoGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021,China; 3.DepartmentofPathology,AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise533000,China; 4.DepartmentofLiverSurgery,RenjiHospitalAffiliatedtoSchoolofMedicineofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200127,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the expression levels of eukaryote DNA polymerase δ 3(POLD3) in the gastric adenocarcinoma (GA) and its clinical significance. MethodsA total of 82 patients with GA undergoing radical resection were selected and the corresponding surgical resection samples were collected. The expression levels of POLD3 in the tissular samples and cell lines of GA were evaluated by immunohistochemistry, western blotting, in vitro cells analysis and real-time quantitative PCR, etc. Next, influence of POLD3 expression levels on tumor proliferation, differentiation and prognosis of GA was analyzed. Results ①Expression levels of POLD3, including mRNA and protein levels, significantly decreased compared with adjacent tumor tissues(P<0.01), and similar results were also found in the in vitro cytology experiments. ②This down-regulating expression of POLD3 promoted tumor dedifferentiation and proliferation.③The levels of POLD3 expression affected GA prognosis, with 34 months and 16 months of middle overall survival time for high and low POLD3 expression, respectively(P<0.01). Overall risk of death of patients with low POLD3 expression levels was 2.43 times (95% confidence interval 1.25～4.71) higher than that of patients with high POLD3 expression. ConclusionPOLD3 expression is down-regulated in the GA, and this down-regulation may be associated with GA proliferation, differentiation and prognosis.

【Key words】POLD3; GA; expression; clinical significance

(收稿日期：2015-12-22修回日期：2016-02-26)

中圖分類號：R735.2

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1003-1383.2016.01.001

作者簡介：陸茵茵，女，病理學專業碩士研究生。E-mail: luyinyin611@qq.com▲通信作者：龍喜帶。E-mail: sjtulongxd@263.net

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81572353，81372639，81160255，81472243，81460423);廣西自然科學基金資助項目

(2013GXNSFAA019251，2014GXNSFDA118021，2014GXNSFAA118144，2015GXNSFAA139223)；上海市曙光學者資助計劃

(13SG19)

馬韻。E-mail: yunandama@hotmail.com