一個(gè)新磷酸酶張力蛋白樣同源物亞型的研究

張謝 譚麟 朱杰 尹博偉 李宏

[摘要] 目的 鑒定新發(fā)現(xiàn)磷酸酶張力蛋白樣同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）亞型的生物活性及潛在的腫瘤抑制作用。 方法 蛋白印跡法、免疫共沉淀法檢測(cè)各細(xì)胞株P(guān)TEN、PTEN亞型（upper PTEN，UPP）的表達(dá)；細(xì)胞轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染PTEN、UPP、空載體于HepG2和PC3細(xì)胞，細(xì)胞增殖法檢測(cè)PTEN、UPP對(duì)各株癌細(xì)胞生長(zhǎng)情況的影響。 結(jié)果 UPP是一種緊密依賴于PTEN而存在的蛋白。UPP不是PTEN蛋白翻譯后修飾產(chǎn)物，可能是PTEN蛋白選擇性剪接體。與轉(zhuǎn)染空載體相比，轉(zhuǎn)染UPP和PTEN于HepG2和PC3細(xì)胞，細(xì)胞增殖明顯抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 UPP可能是PTEN蛋白選擇性剪接產(chǎn)物，可能是一個(gè)新的腫瘤抑制因子。

[關(guān)鍵詞] 磷酸酶張力蛋白樣同源物；腫瘤抑制因子；細(xì)胞增殖；蛋白印跡法；選擇性剪接體

[中圖分類號(hào)] R73 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）09-0001-04

[Abstract] Objective To identify a new phosphatase and tensin homolog（PTEN） subtype and explore its potential role in tumor suppression. Methods Western blotting， immunoprecipitation were used to detect the expression of PTEN subtype（upper PTEN，UPP） and PTEN in different cell lines. PTEN， UPP and mock-vehicle were transfected to HepG2 and PC3 cell lines， then tested PTEN and UPP's effection on tumor suppression by cell proliferation bioassay. Results The expression of UPP closely depended on the existence of PTEN. UPP was not a post-translational modification product by PTEN， rather than its alternative splicing variant. Compared to cells transfected with empty vector alone， HepG2 and PC3 cells transfected with UPP or PTEN inhibited cell proliferation， and there was statistical significance（P<0.05）. Conclusion UPP might be a alternative splicing variant of PTEN and a new tumor suppressor.

[Key words] Phosphatase and tensin homolog； Tumor suppressor； Cell proliferation； Western blot；Alternative splicing variant

磷酸酶張力蛋白樣同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）又被稱為多種晚期癌突變基因（mutated in multiple advanced cancers，MMAC1），是繼p53之后又一個(gè)重要的腫瘤抑制因子[1-4]。我們通常所指的PTEN是一個(gè)含403個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，具有蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶活性[5，6]。自從1997年P(guān)TEN被作為腫瘤抑制因子提出以來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)在多種人類腫瘤中存在PTEN的缺失或突變[1-4，7]。目前針對(duì)PTEN的癌癥治療和其他疾病的治療抱有很高期望。

我們和其他實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)在各種不同的組織和細(xì)胞中存在一個(gè)比PTEN大約大15kDa的同源蛋白[8，9]。此蛋白的存在嚴(yán)格依賴于PTEN的表達(dá)，且表達(dá)豐度和PTEN成正比，我們命其名為UPP（upper PTEN）。研究PTEN基因5'-UTR全序列發(fā)現(xiàn)在第513位核糖核苷酸存在一個(gè)非常規(guī)翻譯起始位點(diǎn)CTG，且UPP在N端比PTEN多173氨基酸[8-10]。本實(shí)驗(yàn)擬鑒定UPP與PTEN關(guān)系，以及UPP潛在腫瘤抑制作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及細(xì)胞株

DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、雙抗（100 U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素）均購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；Anti-Human PTEN（clone 6H2.1）抗體購(gòu)自美國(guó)CASCADE生物公司；α-Actin羊單克隆抗體、GAPDH小鼠單克隆抗體、兔抗人IgG、猴抗羊IgG及羊抗鼠IgG二抗均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。A431、Cos-1、LNCaP、NIH3T3、PC3、293T、U2OS、HCT116、MDA-468、HepG2細(xì)胞株均購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。MEF（PTEN+/+）、MEF（PTEN-/-）細(xì)胞株以及pcDNA3.1-PTEN、pcDNA3.1-UPP、空載體質(zhì)粒由美國(guó)紐約斯隆癌癥中心贈(zèng)送。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

A431、Cos-1、LNCaP、PC3、293T、U2OS、HCT116、NIH3T3、MDA-468、HepG2、MEF（PTEN+/+）、MEF（PTEN-/-）細(xì)胞株用含10%FBS，雙抗（100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素）的高糖 DM EM培養(yǎng)基，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%及飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2×105細(xì)胞/3 mL接種于100 mm培養(yǎng)皿中，等其貼壁長(zhǎng)到全皿的80%～90%時(shí)收蛋白。

按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書將UPP、PTEN質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入HepG2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前1 d，細(xì)胞鋪板于100 mm培養(yǎng)皿中，使其轉(zhuǎn)染日密度為90%。轉(zhuǎn)染試劑用Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋，細(xì)胞也用Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基孵育。轉(zhuǎn)染6 h后，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)基包含10%FBS和抗生素。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，提取蛋白。

1.3 蛋白印跡法（Western blot）檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各細(xì)胞株，分別用含蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液裂解，提取蛋白并定量。取50 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后以5%脫脂牛奶封閉30 min，在1∶1000濃度的Anti-Human PTEN （clone 6H2.1） 抗體及1∶400濃度 α-Actin、GAPDH抗體中室溫孵育2 h，TBST洗滌3次以后，1∶2000濃度的兔抗人IgG以及1∶1000猴抗羊IgG、羊抗鼠IgG二抗室溫孵育1.5 h，TBST洗滌3次，通過(guò)加入BeyoECL Plus顯色液于凝膠成像儀器曝光。

1.4 免疫共沉淀（Immunoprecipitation）檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞株，同上述細(xì)胞裂解后，加入3 μg PTEN抗體，4℃孵育過(guò)夜。將預(yù)處理的20 μL protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過(guò)夜的細(xì)胞裂解液中，4℃孵育2 h。免疫沉淀反應(yīng)后，瓊脂糖珠用裂解液清洗3次，PBS清洗1次，SDS-PAGE分離，western blot分析。

1.5 細(xì)胞增殖檢測(cè)

UPP、PTEN和空載體轉(zhuǎn)染 HepG2、PC3細(xì)胞，G418篩選數(shù)周后獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞。將2×105個(gè)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞種在細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每種表達(dá)細(xì)胞各種15個(gè)培養(yǎng)皿。從第2天開(kāi)始每天取3個(gè)培養(yǎng)皿用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞、計(jì)數(shù)取平均值，連續(xù)5 d。所得平均值以天為橫坐標(biāo)制作生長(zhǎng)曲線，通過(guò)比較各種相應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線判斷UPP、PTEN對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UPP是一種緊密依賴于PTEN而存在的蛋白

利用PTEN特異性抗體并借助免疫共沉淀和蛋白免疫印跡法，結(jié)果顯示在A431、Cos-1、NIH3T3、293T、U2OS、HCT116、MEF（PTEN+/+）細(xì)胞中存在一個(gè)比PTEN約大15kDa的同源蛋白，此蛋白的存在嚴(yán)格依賴于PTEN的表達(dá)，且表達(dá)豐度和PTEN成正比。其中U2OS細(xì)胞存在UPP蛋白，但是表達(dá)量低。而LNCaP、PC3、MEF（PTEN-/-）細(xì)胞中UPP和PTEN均不表達(dá)（圖1）。

2.2 UPP不是PTEN蛋白翻譯后修飾產(chǎn)物

根據(jù)UPP分子量的大小，我們猜測(cè)了幾種可能的翻譯后修飾，如單泛素化、SUMO修飾、Nedd8修飾、ISG15修飾，并加以驗(yàn)證。在293T細(xì)胞中應(yīng)用免疫沉淀法結(jié)果顯示UPP不表達(dá)，提示UPP不是PTEN基因翻譯后修飾產(chǎn)物（圖2）。

2.3 UPP可能是PTEN蛋白選擇性剪接產(chǎn)物

為了進(jìn)一步確認(rèn)UPP與PTEN的關(guān)系，我們轉(zhuǎn)染C-末端HA-，和N-末端 GFP-的PTEN cDNA于COS-1細(xì)胞，使COS-1細(xì)胞過(guò)度表達(dá)PTEN，western blot結(jié)果顯示PTEN表達(dá)量增多，但是不能檢測(cè)到UPP（圖3）。

0.1 μg/mL多西環(huán)素誘導(dǎo)PTEN缺失的MDA-468細(xì)胞，使其PTEN過(guò)表達(dá)，western blot結(jié)果顯示，PTEN隨著誘導(dǎo)時(shí)間表達(dá)量增多，但是仍無(wú)法檢測(cè)到UPP表達(dá)（圖4），以上結(jié)果說(shuō)明UPP很可能是PTEN基因選擇性剪接產(chǎn)物。

2.4 UPP可抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)

UPP、PTEN和空載體轉(zhuǎn)染 HepG2細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞增殖數(shù)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后第1天，UPP、PTEN、空載體組細(xì)胞增殖數(shù)分別為（2.97±0.36）×105、（3.03±0.31）×105、（2.97±0.12）×105，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.17，P=0.85）。轉(zhuǎn)染后第2天，UPP、PTEN、空載體組細(xì)胞增殖數(shù)分別為（4.03±0.57）×105、（4.27±0.68）×105、（6.33±1.03）×105，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.84，P=0.02）；轉(zhuǎn)染后第3天，UPP、PTEN、空載體組細(xì)胞增殖數(shù)分別為（7.23±0.96）×105、（6.57±0.68）×105、（11.03±1.80）×105，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.29，P=0.01）；轉(zhuǎn)染后第4天，UPP、PTEN、空載體組細(xì)胞增殖數(shù)分別為（12.07±1.77）×105、（11.27±1.68）×105、（18.07±2.52）×105，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.13，P=0.01）（圖5）。

UPP、PTEN和空載體轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞增殖數(shù)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后第1天，UPP、PTEN、空載體組細(xì)胞增殖數(shù)分別為（2.99±0.30）×105、（2.75±0.42）×105、（4.18±0.67）×105，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.52，P=0.02）。轉(zhuǎn)染后第2天，UPP、PTEN、空載體組細(xì)胞增殖數(shù)分別為（3.97±0.60）×105、（4.11±0.66）×105、（6.53±0.55）×105，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17.06，P<0.01）；轉(zhuǎn)染后第3天，UPP、PTEN、空載體組細(xì)胞增殖數(shù)分別為（6.48±0.40）×105、（6.56±0.53）×105、（9.97±0.50）×105，各組間差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=52.23，P<0.01）；轉(zhuǎn)染后第4天，UPP、PTEN、空載體組細(xì)胞增殖數(shù)分別為（10.01±0.78）×105、（9.38±0.58）×105、（15.26±0.48）×105，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=79.92，P<0.01）（圖6）。

3 討論

PTEN作為繼p53之后又一個(gè)重要的腫瘤抑制因子，學(xué)者針對(duì)其癌癥治療和其他疾病的治療抱有很高期望。在針對(duì)PTEN的抗癌藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中，PTEN的調(diào)控是國(guó)內(nèi)外研究的一個(gè)熱點(diǎn)。已知的PTEN調(diào)控方式包括氧化、乙酰化、磷酸化、泛素化等[11-14]。其中磷酸化被研究得最多。普遍存在的蛋白激酶CK2能磷酸化PTEN蛋白的C端Ser/Thr殘基[15]。PTEN去磷酸化后，其羥基端C2結(jié)構(gòu)域外露，有助于PTEN實(shí)現(xiàn)膜轉(zhuǎn)移，進(jìn)而發(fā)揮其脂質(zhì)磷酸酶的功能，抑制PI3K-AKT信號(hào)通路[16-18]。去磷酸化后的PTEN相對(duì)不穩(wěn)定，在執(zhí)行完功能后通常通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑被降解掉，但是CK2磷酸化的對(duì)象廣泛，雖然通過(guò)抑制CK2能夠激活PTEN，但因?yàn)槠渌鸆K2底物也受影響，副作用大[19]。

PTEN另一個(gè)被重點(diǎn)研究的翻譯后修飾是泛素化，泛素化后的PTEN經(jīng)由蛋白酶體降解[20，21]。臨床顯示很多癌癥樣本中的PTEN泛素化酶水平偏高，說(shuō)明泛素化介導(dǎo)的PTEN降解可能是癌癥發(fā)生的一個(gè)重要原因[20-22]。有趣的是，PTEN泛素化不僅導(dǎo)致它的降解。除了常見(jiàn)的多泛素化修飾PTEN還可被單泛素化修飾。Pier Paolo Pandolfi 實(shí)驗(yàn)室報(bào)道PTEN的單泛素化幫助PTEN實(shí)現(xiàn)細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)[22]。臨床上，從Cowden syndrome患者中發(fā)現(xiàn)的PTEN突變體K13E和K289E（兩個(gè)重要的泛素化位點(diǎn)）雖然保留完整的脂質(zhì)磷酸酶活性，卻因?yàn)椴荒鼙粏畏核鼗瑹o(wú)法轉(zhuǎn)運(yùn)入核行使抑癌功能[23]。這種單泛素化和多泛素化的矛盾給以PTEN泛素化酶為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)癌癥新藥物帶來(lái)困惑。

利用多種PTEN特異性抗體并借助蛋白免疫印跡法，我們研究顯示在各種不同的組織和細(xì)胞中存在一個(gè)比PTEN大約大15kDa的同源蛋白——UPP。根據(jù)UPP分子量的大小，我們猜測(cè)了幾種可能的翻譯后修飾，如單泛素化、SUMO修飾、Nedd8修飾、ISG15修飾，并加以驗(yàn)證。這幾種可能都被一一排除。用PTEN的cDNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞瞬間表達(dá)或在PTEN缺失細(xì)胞中長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)PTEN的表達(dá)不能產(chǎn)生UPP，說(shuō)明UPP很可能是PTEN基因轉(zhuǎn)錄選擇性剪接產(chǎn)生的同源蛋白。

Hopkins等[9]是最早報(bào)道關(guān)于PTEN的亞基，他們將其命名為PTEN-Long，其具有膜脂質(zhì)磷酸酶滲透性，由細(xì)胞分泌，并能進(jìn)入其他細(xì)胞[9]。PTEN-Long的變異翻譯起始于上游519bp位點(diǎn)的CUG，N端比PTEN多173個(gè)氨基酸，與我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的UPP一樣。研究顯示PTEN-Long與PTEN一樣可以通過(guò)調(diào)控PI3K-AKT途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。之后Liang等[24]又發(fā)現(xiàn)一個(gè)PTEN亞基，命名為PTENα，其位于線粒體，與PTEN一起調(diào)控線粒體能量代謝。PTENα也是另一種翻譯剪接體，但是其翻譯也起源于上游一個(gè)非常規(guī)翻譯密碼CUG，其N段比PTEN多了一個(gè)173氨基酸（人類）或者169個(gè)氨基酸（小家鼠類）。但是PTEN-Long和PTENα調(diào)控的是兩個(gè)不同的生物學(xué)途徑，故他們可能是兩個(gè)不同的PTEN亞基。

轉(zhuǎn)染UPP于HepG2肝癌細(xì)胞可抑制其增殖，說(shuō)明UPP抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。通常認(rèn)為通過(guò)腺病毒將PTEN的cDNA重新引入有PTEN基因缺陷的患者體內(nèi)，可以抑制因PI3K-AKT通路過(guò)于活躍導(dǎo)致的癌癥[25]。但是，越來(lái)越多的臨床報(bào)道顯示腺病毒介導(dǎo)的基因治療存在安全隱患，接受基因治療的患者并沒(méi)有像所期望的那樣從癌癥中康復(fù)，有相當(dāng)一部分患者出現(xiàn)了由腺病毒導(dǎo)致的各類副作用包括新的癌癥。新發(fā)現(xiàn)的UPP蛋白可能可以規(guī)避以PTEN基因治療帶來(lái)的副作用，為針對(duì)UPP設(shè)計(jì)治療癌癥和其他PTEN相關(guān)疾病的新方法提供依據(jù)。

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（收稿日期：2015-12-11）