氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析 3種方法提取的三七揮發(fā)性成分

謝林伯，戴衛(wèi)國(guó)，孫　毅，程　剛，胡容峰，2，3，王　斌，2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，安徽 合肥　230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥　230038；3.安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥　230038)

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氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析 3種方法提取的三七揮發(fā)性成分

謝林伯1，戴衛(wèi)國(guó)1，孫毅1，程剛1，胡容峰1，2，3，王斌1，2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，安徽 合肥230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230038；3.安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230038)

[摘要]目的運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)不同方法提取的三七揮發(fā)性成分進(jìn)行比較分析。方法分別采用回流提取法、超聲提取法、靜態(tài)頂空法提取三七揮發(fā)油，運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，運(yùn)用NIST11.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫和峰面積歸一化法對(duì)已分離的化合物進(jìn)行鑒定并計(jì)算各成分的相對(duì)含量。結(jié)果從回流提取、超聲提取、靜態(tài)頂空法提取的三七揮發(fā)油中分別鑒定出60、50、24個(gè)揮發(fā)性成分。在靜態(tài)頂空法中相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的是香檜烯，占揮發(fā)性成分的24.97%；在回流提取法和超聲提取法中相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的都是聚炔類物質(zhì)環(huán)氧十三烷-4，11-二炔，分別占揮發(fā)性成分的9.97%和14.75%。首次從三七揮發(fā)性成分中鑒定出3個(gè)聚炔類化合物和2個(gè)甾體類化合物。結(jié)論三七中揮發(fā)性成分主要為烷烴類、烯烴類、醛類、酸類、酯類、萜類、聚炔類、甾體類和雜環(huán)類物質(zhì)。3種方法的補(bǔ)充利用可較全面地提取出三七中的揮發(fā)性物質(zhì)。

[關(guān)鍵詞]三七；揮發(fā)性成分；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

三七原植物為人參三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen，屬名貴中藥材而受到外界重視。其功效為滋補(bǔ)強(qiáng)壯、止血化瘀、消腫止痛[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，三七的揮發(fā)油為其重要的有效成分，具有神經(jīng)保護(hù)、抗氧化等作用[2]。三七揮發(fā)油的提取主要采用水蒸氣蒸餾法[3]、溶劑提取法[4]等。然而，靜態(tài)頂空進(jìn)樣[5]也是中藥揮發(fā)性成分提取時(shí)常用的方法，但該法還未用于三七揮發(fā)性成分的鑒定。本實(shí)驗(yàn)首次將回流提取法、超聲提取法以及靜態(tài)頂空進(jìn)樣3種方法所提取的三七揮發(fā)油進(jìn)行比較分析，為三七的進(jìn)一步開發(fā)利用提供借鑒。

1儀器和試藥

SCION 456-GC-MS聯(lián)用儀：美國(guó)Bruker公司，配置美國(guó)Bruker公司的CP-8400自動(dòng)進(jìn)樣器和SHS-40頂空自動(dòng)進(jìn)樣器，質(zhì)譜檢索數(shù)據(jù)庫NIST 11.L；HS10260D型超聲清洗器：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；BP211D型十萬分之一電子天平：德國(guó)賽多利斯公司。

三七藥材購于安徽省亳州市藥材市場(chǎng)，產(chǎn)地云南，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院孟楣主任藥師鑒定為五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen 的干燥根，樣本存放于安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心。正己烷、乙酸乙酯為分析純，甲醇為色譜純。

2方法和結(jié)果

2.1提取方法

2.1.1回流提取稱取三七藥材20.0 g，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過180目篩。取粉碎后的三七藥材2.0 g于100 mL兩口圓底燒瓶中，加入正己烷50 mL，精密稱定總質(zhì)量，加熱回流1.0 h，停止加熱并冷卻至室溫，稱定質(zhì)量，用正己烷補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，進(jìn)樣前過0.45 μm有機(jī)濾膜。

2.1.2超聲提取稱取上述粉碎后的三七藥材粉末2.0 g于100 mL具塞錐形瓶中，加入正己烷50 mL，精密稱定總質(zhì)量，超聲提取1.0 h，冷卻至室溫，再稱定質(zhì)量，用正己烷補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.45 μm有機(jī)濾膜，取續(xù)濾液1.0 μL進(jìn)樣分析。

2.1.3靜態(tài)頂空提取取20 mL頂空進(jìn)樣瓶1支，將上述粉碎后的2.0 g三七藥材粉末放入瓶中，用鋁蓋密封后置于頂空進(jìn)樣器上。樣品瓶加熱溫度為90 ℃，加熱時(shí)間為20 min，樣品瓶在加熱過程中選擇搖晃的方式；定量環(huán)溫度為115 ℃，定量環(huán)容積為0.25 mL；傳輸線溫度為130 ℃。

2.2色譜及質(zhì)譜條件

2.2.1氣相色譜條件氣相色譜儀和頂空進(jìn)樣器

載氣分別為高純氦和高純氮?dú)猓兌染笥?9.999%(南京上元工業(yè)氣體廠)；采用BR-17型石英毛細(xì)管色譜柱(0.25 μm×250 μm×30 m)進(jìn)行分析，柱流量1.0 mL/min，采用不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0 μL。氣相色譜儀的進(jìn)樣口溫度為260 ℃；為避免溶劑對(duì)燈絲壽命的影響，將溶劑延時(shí)時(shí)間設(shè)為4.0 min。柱溫箱程序升溫條件：初始溫度為40 ℃，以20 ℃/min的速度升溫至100 ℃并保持3 min，在49.0 min時(shí)升溫至220 ℃并保持3 min，最后升溫至280 ℃，分析時(shí)長(zhǎng)共計(jì)61.0 min。

2.2.2質(zhì)譜條件采用EI離子源并將電子轟擊的能量設(shè)為70 eV；離子源溫度、傳輸線溫度和四級(jí)桿溫度分別為230 ℃、280 ℃和40 ℃。實(shí)驗(yàn)采用全掃模式并輔助NIST 11.L進(jìn)行匹配分析，m/z為50～800。

2.3氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果

2.3.1藥材三七中揮發(fā)性成分的總離子流圖在“2.2”項(xiàng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件下，對(duì)3種不同提取方法所得的三七揮發(fā)性成分進(jìn)行分離，各方法的氣相色譜圖見圖1。

注：A.靜態(tài)頂空提取；B.回流提取；C.超聲提取。

圖1不同提取方法所得揮發(fā)性成分總離子流圖

2.3.2三七揮發(fā)性成分分析參照文獻(xiàn)及NIST 11.L質(zhì)譜檢索標(biāo)準(zhǔn)庫，筆者從分離出的139個(gè)色譜峰中共鑒定出了81個(gè)色譜峰。其中，3個(gè)聚炔類化合物和2個(gè)甾體類化合物均為首次從三七藥材中鑒定出。采用面積歸一化法測(cè)定各成分相對(duì)含量，成分鑒定及相對(duì)含量結(jié)果見表1。

表1　三七中81種揮發(fā)性成分氣相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果

續(xù)表1

續(xù)表1

注：*為首次從三七揮發(fā)性成分中鑒定出的化合物。

從靜態(tài)頂空法提取的三七揮發(fā)性成分中共鑒定出24種化合物，占靜態(tài)頂空法提取的揮發(fā)性成分的96.45%。其中有6種成分的相對(duì)含量超過5%，從高到低依次為香檜烯(24.97%)，大良香葉烯(15.84%)，蛇麻烯(8.66%)，正己醛(8.54%)，γ-欖香烯(7.14%)和2-戊基呋喃(5.49%)。從回流提取法提取的三七揮發(fā)性成分中共鑒定出60種化合物，占總成分的77.85%。其中環(huán)氧十三烷-4，11-二炔(9.97%)，人參炔醇(9.41%)，糠醛(4.47%)，角鯊烯(3.36%)，亞油酸(2.30%)，γ-欖香烯(2.19%)，2-甲基糠醛(2.14%)，甲酸烯丙酯(2.11%)，2，6-二甲基十六烷(2.04%)，十六酸甲酯(1.8%)，10，12-十八二炔酸(1.51%)含量較高。從超聲提取法提取的三七揮發(fā)性成分中共鑒定出50種化合物，其中有4種成分的相對(duì)含量超過3%，從高到低依次為環(huán)氧十三烷-4，11-二炔(14.75%)，人參炔醇(12.22%)，角鯊烯(7.68%)和10，12-十八二炔酸(3.19%)。這50種化合物占總成分的87.34%。

回流提取法和超聲提取法提取的揮發(fā)油在成分上差別較小，但相對(duì)含量差別較大。相比較而言，靜態(tài)頂空法提取的揮發(fā)油與二者的差異性較大。在靜態(tài)頂空法中相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的是香檜烯，占揮發(fā)性成分的24.97%，而此成分在回流提取法和超聲提取中幾乎未見，是否因?yàn)橄銠u烯在后兩者提取法中與三七其他成分間發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，從而造成如此大的差異，還需進(jìn)一步研究。而在回流提取法和超聲提取法中，相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的都是聚炔類物質(zhì)環(huán)氧十三烷-4，11-二炔，分別占各自總揮發(fā)性成分的9.97%和14.75%。此外，靜態(tài)頂空法提取的揮發(fā)性成分沸點(diǎn)較低，出峰時(shí)間主要在40 min以內(nèi)，且化合物分子量不超過220；而回流提取法和超聲提取法提取的揮發(fā)性成分沸點(diǎn)相對(duì)較高，一些不易揮發(fā)的聚炔類物質(zhì)和分子量超過400的甾體類化合物也可被鑒定出。聚炔類和甾體類化合物不易揮發(fā)且沸點(diǎn)較高。筆者認(rèn)為，采用靜態(tài)頂空法時(shí)，由于樣品瓶的加熱溫度一般小于100 ℃，不能將聚炔類和甾體類化合物從三七中“趕出”，故在靜態(tài)頂空法中未能鑒定出聚炔類和甾體類化合物。而采用回流提取法和超聲提取法時(shí)，聚炔類和甾體類化合物在有機(jī)溶劑正己烷中可被溶解，并在氣相色譜進(jìn)樣口的高溫下被“氣化”后隨載氣進(jìn)入色譜柱，從而實(shí)現(xiàn)分離鑒定。

此外，在回流提取法和超聲提取法提取的揮發(fā)油中均發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新的聚炔類化合物：2，5-十八烷二炔酸甲酯、10，12-十八二炔酸和環(huán)氧十三烷-4，11-二炔。以及2個(gè)新甾體類化合物：2-亞甲基-3-羥基二氫膽固醇和雄甾烯二醇。

3結(jié)論

三七中揮發(fā)性成分主要為烷烴類、烯烴類、醛類、酸類、酯類、萜類、聚炔類、甾體類和雜環(huán)類物質(zhì)。主要成分中萜類物質(zhì)香檜烯廣泛用于醫(yī)藥、香精香料和日化用品中[6]；聚炔類物質(zhì)人參炔醇具有抗癌、降壓和神經(jīng)保護(hù)等作用[7]；甾體類物質(zhì)雄甾烯二醇具有顯著促進(jìn)肌肉增長(zhǎng)、加速恢復(fù)等作用[8]。

筆者首次對(duì)不同提取方法所得三七揮發(fā)性成分進(jìn)行分離鑒定，其中聚炔類物質(zhì)環(huán)氧十三烷-4，11-二炔，2，5-十八烷二炔酸甲酯和10，12-十八二炔酸以及甾體類物質(zhì)2-亞甲基-3-羥基二氫膽固醇和雄甾烯二醇為首次從三七藥材中鑒定出。3種方法的補(bǔ)充利用可較全面地反映出三七中的揮發(fā)性物質(zhì)，為三七的進(jìn)一步開發(fā)利用提供借鑒。

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Analysis of Volatile Components in Panax notoginseng Extracted with Three Extraction Methods by Gas Chromatography-Mass Spectrometry

XIELin-bo1,DAIWei-guo1,SUNYi1,CHENGGang1,HURong-feng1,2,3,WANGBin1,2

(1.ExperimentalResearchCenter,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 2.KeyLaboratoryofXin’anMedicine,MinistryofEducation,AnhuiHefei230038,China; 3.AnhuiProvinceKeyLaboratoryofR&DofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

[Abstract]ObjectiveTo comparatively analyze the volatile components in Panax notoginseng extracted with different methods by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). MethodsThe volatile components in Panax notoginseng were extracted by reflux extraction, ultrasonic extraction, and static headspace extraction. The volatile components were identified by GC-MS and NIST mass spectral database (11.0), and the relative content of these compounds was determined by peak area normalization. ResultsSixty, fifty, and twenty-four constituents were identified from the volatile compounds extracted through reflux extraction, ultrasonic extraction, and static headspace extraction, respectively. Among all the volatile components extracted by static headspace extraction, sabinene was the most predominant component, accounting for 24.97% of the total. Among all the volatile components extracted by reflux extraction and ultrasonic extraction, oxacyclotetradeca-4,11-diyne was the most predominant component, accounting for 9.97% and 14.75%, respectively, of the total. Three polyacetylenes and two steroids were identified from the volatile components of Panax notoginseng for the first time. ConclusionThe main components of volatile components include alkanes, olefins, aldehydes, acids, esters, terpenes, polyacetylenes, steroids, and heterocyclic compounds. The volatile components in Panax notoginseng can be extracted fully by taking advantage of three different methods.

[Key words]Panax notoginseng; Volatile component; Gas chromatography-mass spectrometry

(收稿日期：2015-10-29；編輯：曹健)

[中圖分類號(hào)]R284[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.02.026

通信作者：王斌，wangbin--5654@163.com

作者簡(jiǎn)介：謝林伯(1994-)，男，在讀本科生

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAI26B03)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81274100)