我國耐喹諾酮類嗜水氣單胞菌毒力基因及耐藥基因檢出情況的系統(tǒng)評(píng)價(jià)

牛志偉 呂小麗 范華龍 梁靜真 蒙蘭麗 韓書煜 黃鈞

摘要：【目的】了解我國耐喹諾酮類致病性嗜水氣單胞菌主要毒力基因及引起耐藥基因的突變情況，為致病性嗜水氣單胞菌的防治及毒力基因和耐喹諾酮類藥物機(jī)制的研究提供參考依據(jù)。【方法】通過計(jì)算機(jī)檢索中國知網(wǎng)（CNKI）數(shù)據(jù)庫、萬方數(shù)據(jù)庫、維普（VIP）中文科技期刊數(shù)據(jù)庫、讀秀知識(shí)庫等，檢索時(shí)限均從建庫至2016年4月，查找收集有關(guān)嗜水氣單胞菌對(duì)喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制研究及其毒力基因、致病機(jī)理的相關(guān)文獻(xiàn)，采用Cochrane協(xié)作網(wǎng)發(fā)布的RevMan 5.3進(jìn)行常規(guī)Meta分析，以加拿大衛(wèi)生藥品技術(shù)總署編寫的ITC軟件進(jìn)行間接比較Meta分析?！窘Y(jié)果】最終納入31篇文獻(xiàn)，其中有19篇檢測了致病菌株的毒力基因，含457株菌株；11篇檢測了致病菌株的耐藥基因，共101株菌株；8篇檢測了耐藥菌株的耐藥基因突變位點(diǎn)，共88株菌株。我國致病性嗜水氣單胞菌毒力基因的檢出率為：astA基因91.30%、altA基因80.42%、aerA基因72.77%、hlyA基因66.85%、actA基因62.13%、ahpA基因56.18%、ahaI基因53.04%?；春右员钡貐^(qū)主要以hlyA基因?yàn)橹?，檢出率（67.31%）顯著高于淮河以南地區(qū)（P<0.05，下同），且高于全國平均檢出率；淮河以南地區(qū)主要以actA基因?yàn)橹?，檢出率（93.59%）顯著高于淮河以北地區(qū)，也高于全國平均檢出率。質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因檢出率為：qnrB基因50.00%、qepA基因32.00%、qnrS基因27.91%、qnrA基因6.98%、qnrC和qnrD基因未檢出。gyrA83位點(diǎn)單突變檢出率顯著高于gyrA83、parC87雙位點(diǎn)突變檢出率[OR=0.49，95% CI（0.08， 3.09），P=0.008]?！窘Y(jié)論】我國致病性嗜水氣單胞菌的分子檢測方法為：淮河以南地區(qū)以毒力基因actA和aerA為致病性強(qiáng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)，淮河以北地區(qū)以毒力基因hlyA和aerA為致病性強(qiáng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)。目前我國耐喹諾酮類嗜水氣單胞菌的基因突變位點(diǎn)主要是gyrA83單位點(diǎn)突變和gyrA83、parC87雙位點(diǎn)突變。

關(guān)鍵詞： 嗜水氣單胞菌；毒力基因；耐藥基因；Meta分析

中圖分類號(hào)： S941.42 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）09-1587-09

Abstract：【Objective】The detection situation of main virulence genes in quinolones-resistant pathogenic Aeromonas hydrophila and resulting mutation of drug-resistant gene and in China， in order to provide reference for study on control of A. hydrophila and its virulence genes and quinolone-resistant molecular mechanisms. 【Method】The reports on quinolones-resistant molecular mechanisms， virulence genes and pathogenesis of A. hydrophila was collected by computer-based online search of CNKI， WANFANG DATA， VIP in Chinese science and technology periodical database and Duxiu Knowledge Base（from setting-up database to April 2016）. Then Meta analysis was performed by Review Manager 5.3 published by Cochrane Collaboration network， and indirect comparative Meta analysis was performed by ITC published by Canadian Health Pharmaceutical Technology Agency. 【Result】A total of 31 literatures were included， 19 of which detected virulence genes of pathogenic strains（457 strains）， 11 of which detected drug-resistant genes of pathogenic strains（101 strains）， 811 of which detected mutational site of drug-resistant gene in drug-resistant strains（88 strains）. The detection rates of virulence genes of pathogenic A. hydrophila in China were as follows： astA 91.30%， altA 80.42%， aerA 72.77%， hlyA 66.85%， actA 62.13%， ahpA 56.18%， ahaI 53.04%. North of the Huaihe River was dominated by hlyA gene， with detection rates of 67.31%， and significantly higher than the south of Huaihe River（P<0.05， the same below）， and higher than the national average detection rate. South of the Huaihe River was dominated by actA gene， with detection rate of 93.59%， and significantly higher than north of the Huaihe River area， and higher than the national average detection rate too. The detection rates of plasmid-mediated drug-resistant genes of pathogenic A. hydrophila in China were as follows： qnrB 50.00%， qepA 32.00%， qnrS 27.91%， qnrA 6.98%， but qnrC and qnrD were undetected. The detection rate of single site mutation of gyrA83 site was significantly higher than that of double sites mutations of gyrA83 and parC87[OR=0.49， 95% CI（0.08， 3.09）， P=0.008]. 【Conclusion】The detection method of pathogenic A. hydrophila in China： actA and aerA are taken as judgment standard of strong pathogenicity in south of the Huaihe River； hlyA and aerA are taken as judgment standard of strong pathogenicity in north of the Huaihe River. At present， mutational site of gene is mainly gyrA83 single site mutation and gyrA83， parC87 double sites mutations in quinolones-resistant A. hydrophila in China.

Key words： Aeromonas hydrophila； virulence gene； drug-resistant gene； Meta analysis

0 引言

【研究意義】嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）隸屬于氣單胞菌科（Aermonadaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas），廣泛存在于各種水體中，是嚴(yán)重危害水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物健康的致病菌之一，每年給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，從分子水平上系統(tǒng)評(píng)價(jià)嗜水氣單胞菌毒力基因分布及相關(guān)耐藥機(jī)制的研究情況，對(duì)全面系統(tǒng)地掌握該菌的致病和耐藥特點(diǎn)及降低其對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖造成的經(jīng)濟(jì)損失均具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】至今，國內(nèi)外學(xué)者已對(duì)嗜水氣單胞菌的致病機(jī)理和耐藥機(jī)制進(jìn)行了大量研究，主要包括毒力基因檢測及其與致病力的關(guān)系、耐藥基因及其突變位點(diǎn)的研究，并證實(shí)嗜水氣單胞菌的致病力與毒力基因密切相關(guān)。方兵（2005）應(yīng)用多重PCR確定毒力基因altA、ahai、hlyA是15株氣單胞菌的主要毒力基因型；胡靖（2006）研究發(fā)現(xiàn)，不同來源嗜水氣單胞菌毒力基因的分布和致病性的差別可能是受菌體多種條件綜合作用所致；朱大玲等（2006）通過比較基因檢測的結(jié)果與嗜水氣單胞菌對(duì)鯽魚的致病性，發(fā)現(xiàn)ahpA陽性嗜水氣單胞菌皆為毒力菌株，且aerA與ahpA基因存在相關(guān)性；付喬芳（2011）通過比較嗜水氣單胞菌毒力基因的分布情況及其對(duì)異育銀鯽的致病性，發(fā)現(xiàn)aerA、ahpA基因?yàn)槭人畾鈫伟虏〉闹饕玖σ蜃?，與致病性存在相關(guān)性，astA基因與其致病力也存在一定相關(guān)性，但不是主要毒力因子。嗜水氣單胞菌的耐藥機(jī)制主要在于耐藥基因的存在及質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥喹諾酮類藥物作用靶位的改變。Giraud等（2004）、Alcaide等（2010）、Han等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，耐喹諾酮類不同種的氣單胞菌主要是gyrA基因編碼的第83位氨基酸發(fā)生Ser→Ile突變，也有部分是第83位氨基酸發(fā)生Ser→Arg、Val或Asn突變，同時(shí)存在第92、174、202和203位氨基酸位點(diǎn)突變。王曉豐等（2010）研究表明，大多數(shù)耐喹諾酮菌株的靶位基因QRDR區(qū)域有突變發(fā)生，但藥物靶位的變化并非氟喹諾酮類耐藥菌株唯一的抗性機(jī)制。薛慧娟等（2012）以PCR擴(kuò)增耐喹諾酮嗜水氣單胞菌的靶基因gyrA和parC，發(fā)現(xiàn)耐藥嗜水氣單胞菌QRDR區(qū)域的突變具有隨機(jī)性，但靶位點(diǎn)gyrA的83Ser→Ile及parC的87Ser→Ile是最主要的突變方式；此外，喹諾酮類耐藥性的產(chǎn)生可能與其他耐藥機(jī)制存在關(guān)聯(lián)。譚愛萍等（2014）通過對(duì)龜鱉源氣單胞菌耐藥性的分析，發(fā)現(xiàn)喹諾酮藥物耐藥機(jī)制復(fù)雜，PMQR通常僅導(dǎo)致喹諾酮類低水平的耐藥，但PMQR基因的存在可促進(jìn)細(xì)菌染色體QRDR變異，從而導(dǎo)致具有穩(wěn)定遺傳性的高水平耐藥性產(chǎn)生。【本研究切入點(diǎn)】目前，雖然對(duì)嗜水氣單胞菌致病性與毒力基因的關(guān)系及耐藥性與耐藥基因突變已有一定了解，但針對(duì)致病性嗜水氣單胞菌毒力基因和耐藥基因的系統(tǒng)評(píng)價(jià)尚無報(bào)道。Meta分析是對(duì)多個(gè)相同研究結(jié)果進(jìn)行合并匯總的分析方法，可從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度達(dá)到增大樣本量，從而提高檢驗(yàn)效能的目的，尤其當(dāng)多個(gè)研究結(jié)果不一致時(shí)，采用Meta分析可得到更加接近真實(shí)情況的綜合分析結(jié)果，同時(shí)能克服敘述性綜述的片面性和主觀性等缺點(diǎn)。Meta分析已廣泛應(yīng)用于環(huán)境科學(xué)（時(shí)鵬等，2012）、心理學(xué)（劉霞等，2013）、人類醫(yī)學(xué)（梁錦枝等，2013）、經(jīng)濟(jì)學(xué)（彭俞超和顧雷雷，2014）、畜牧獸醫(yī)科學(xué)（楊健等，2016）等領(lǐng)域，但在水產(chǎn)科學(xué)領(lǐng)域尚無相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于Meta分析對(duì)近年來我國關(guān)于嗜水氣單胞菌毒力基因及耐喹諾酮類嗜水氣單胞菌耐藥機(jī)制的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，了解我國耐喹諾酮類致病性嗜水氣單胞菌主要毒力基因及引起耐藥基因的突變情況，為致病性嗜水氣單胞菌的防治及毒力基因和耐喹諾酮類藥物機(jī)制的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1. 1. 1 研究類型 所有檢測耐喹諾酮類致病性嗜水氣單胞菌相關(guān)毒力基因和以敏感菌株或標(biāo)準(zhǔn)菌株作為對(duì)照檢測耐藥基因及其突變的試驗(yàn)，語言限定為中文。

1. 1. 2 研究對(duì)象 經(jīng)藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的耐喹諾酮類嗜水氣單胞菌（包括人工誘導(dǎo)產(chǎn)生的）及敏感菌。

1. 1. 3 干預(yù)措施 試驗(yàn)組和對(duì)照組均通過PCR檢測嗜水氣單胞菌耐藥基因及毒力基因。

1. 1. 4 結(jié)局指標(biāo) 檢測出的毒力基因和耐藥基因。

1. 1. 5 排除標(biāo)準(zhǔn) 數(shù)據(jù)不詳或無法運(yùn)用的研究，具體包括：①未進(jìn)行藥敏試驗(yàn)或攻毒試驗(yàn)的研究；②檢測方法不可靠和未使用PCR檢測毒力基因；③綜述文獻(xiàn)、重復(fù)檢出或發(fā)表及只有摘要的會(huì)議文獻(xiàn)；④只檢測耐藥基因，未進(jìn)行突變位點(diǎn)突變的研究；⑤只進(jìn)行藥敏鑒定未檢測耐藥基因的研究、理論探討的研究或報(bào)道；⑥研究菌株不是來自水生動(dòng)物（水體，陸生動(dòng)物）的研究；⑦同一作者或在實(shí)驗(yàn)室的人員在相同年度發(fā)表的相似研究；⑧試驗(yàn)菌株總數(shù)小于2株的研究。

1. 2 檢索策略

計(jì)算機(jī)檢索中國知網(wǎng)（CNKI）數(shù)據(jù)庫、萬方數(shù)據(jù)庫、維普（VIP）中文科技期刊數(shù)據(jù)庫、讀秀知識(shí)庫等，檢索時(shí)限均為建庫至2016年4月。以嗜水氣單胞菌、喹諾酮類耐藥性和毒力基因作為檢索詞，在上述數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，并追溯納入文獻(xiàn)的中文參考文獻(xiàn)。

1. 3 文獻(xiàn)篩選與資料提取

提取內(nèi)容包括：作者、年份、菌株來源、菌株數(shù)量、毒力基因、耐藥基因、突變位點(diǎn)、主動(dòng)外排系統(tǒng)及對(duì)照組（敏感菌株或標(biāo)準(zhǔn)菌株）等，數(shù)據(jù)不詳則聯(lián)系作者索要數(shù)據(jù)或在相關(guān)信息處填寫不詳。由兩名評(píng)價(jià)人員按上述標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)納入的相關(guān)文獻(xiàn)獨(dú)立進(jìn)行評(píng)價(jià)和提取相關(guān)數(shù)據(jù)，然后交叉核對(duì)，遇到分歧則討論解決。

1. 4 統(tǒng)計(jì)分析

檢出數(shù)據(jù)采用比值比（OR）及其95% CI作為檢出統(tǒng)計(jì)量，采用χ2對(duì)文獻(xiàn)進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)，P≥0.10且I2≤50%時(shí)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；反之，使用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用RevMan 5.3進(jìn)行常規(guī)Meta分析，以加拿大衛(wèi)生藥品技術(shù)總署編寫的ITC軟件進(jìn)行間接比較Meta分析；率的比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果

共檢出耐喹諾酮類嗜水氣單胞菌毒力基因、耐藥基因相關(guān)文章312篇，經(jīng)逐層篩選后，最終納入31篇，其中有19篇檢測了致病菌株的毒力基因，含457株菌株（表1）；11篇檢測了致病菌株的耐藥基因，含101株菌株；8篇檢測了耐藥菌株的耐藥基因突變位點(diǎn)，含88株菌株（表2）。由于不同文獻(xiàn)對(duì)相同毒力基因的縮寫不同，為了便于統(tǒng)計(jì)，本研究以毒力基因英文縮寫+嗜水氣單胞菌英文首字母作為該毒力基因的引文縮寫（altA、aerA、hlyA、actA和ahpA），若毒力基因縮寫結(jié)尾為字母A，則用嗜水氣單胞菌縮寫ah+毒力基因英文縮寫作為嗜水氣單胞菌相關(guān)毒力因子縮寫（ahpA）。文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果見圖1。

2. 2 毒力基因的檢出情況

由表3可知，我國致病性嗜水氣單胞菌毒力基因astA、altA、aerA、hlyA、actA、ahpA、ahaI檢出率均大于50.00%，分別為91.39%、80.42%、72.77%、66.85%、62.13%、56.18%和53.04%。其中以astA基因最高，altA和aerA基因次之。取單一地區(qū)來源且文獻(xiàn)數(shù)目大于1篇的菌株進(jìn)行南北地區(qū)（以氣候特點(diǎn)劃分地區(qū)）相關(guān)毒力基因檢出率差異統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，aerA、hlyA、actA和ahpA 4種毒力基因在淮河以北地區(qū)主要以hlyA基因?yàn)橹?，檢出率（67.31%）高于淮河以南地區(qū)（表4），其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，下同），且高于全國平均檢出率；而淮河以南主要以actA基因?yàn)橹鳎?3.59%），高于淮河以北地區(qū)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也高于全國平均檢出率。aerA基因檢出率在淮河以南和淮河以北均位于第二，且淮河以南地區(qū)高于淮河以北地區(qū)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；淮河以北地區(qū)的ahpA基因檢出率高于淮河以南地區(qū)，但其差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2. 3 耐藥基因、主動(dòng)外排泵、整合子耐藥基因突變的檢測結(jié)果

質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因主要是qnra、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qnrR和qepA，但僅有4篇納入文獻(xiàn)（王小亮等，2013；方一風(fēng)等，2014；喬毅，2015；張明輝等，2016）檢測了質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因，而且沒有一篇文獻(xiàn)將上述所有基因完全檢測，合并后的檢出率分別為qnrB基因50.00%、 qepA基因32.00%、qnrS基因27.91%、qnrA基因6.98%，qnrC和qnrD基因未檢出。即由質(zhì)粒介導(dǎo)嗜水氣單胞菌產(chǎn)生耐藥的主要耐藥基因是qnrB、qepA和qnrS（表5）。

有3篇納入文獻(xiàn)采用外排泵抑制劑羰基氰化氯苯腙（CCCP）誘導(dǎo)嗜水氣單胞菌對(duì)喹諾酮類藥物的MIC變化進(jìn)行功能性主動(dòng)外排檢測。其中，杜娜（2013）通過觀察CCCP誘導(dǎo)嗜水氣單胞菌耐藥株對(duì)左氧氟沙星的MIC變化進(jìn)行功能性主動(dòng)外排檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)喹諾酮耐藥性的產(chǎn)生與外排泵機(jī)制相關(guān)；鄧玉婷等（2014）通過對(duì)比CCCP誘導(dǎo)嗜水氣單胞菌對(duì)恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星4種喹諾酮類藥物的MIC變化進(jìn)行功能性主動(dòng)外排檢測，結(jié)果表明隨著用藥壓力的逐漸增加，外排作用協(xié)同突變機(jī)制，進(jìn)一步增加菌株對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥性，說明耐喹諾酮類嗜水氣單胞菌存在靶基因突變和主動(dòng)外排作用等多種耐藥機(jī)制；方一風(fēng)等（2014）通過加入CCCP觀察嗜水氣單胞菌對(duì)恩諾沙星的MIC變化進(jìn)行功能性主動(dòng)外排檢測，并檢測外排泵相關(guān)基因qepA、oqxA和mdfA，結(jié)果顯示主動(dòng)外排泵機(jī)制只是個(gè)別菌株存在的耐藥機(jī)制。

有2篇納入文獻(xiàn)對(duì)整合子進(jìn)行了檢測。肖根輝（2012）從臨床分離獲得的嗜水氣單胞菌中證實(shí)了Ⅰ類和Ⅱ類整合子的存在，兩種整合子的檢出率分別為33.3%和88.9%。李紹戊等（2013）的研究結(jié)果表明，含有Ⅰ類、Ⅱ類整合子的嗜水氣單胞菌菌株耐藥率明顯高于不含整合子的陰性菌株，且整合子的存在會(huì)影響其對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥性。

目前，關(guān)于嗜水氣單胞菌對(duì)喹諾酮類耐藥的基因突變主要是gyrA和parC相關(guān)位點(diǎn)的研究。本研究共納入7篇文獻(xiàn)進(jìn)行耐喹諾酮類嗜水氣單胞菌與對(duì)照組（敏感菌/標(biāo)準(zhǔn)株）單gyrA基因突變檢出情況的Meta分析，異質(zhì)性檢測提示各研究間無異質(zhì)性（P=0.60，I2=0%），可采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析，結(jié)果表明，耐喹諾酮類嗜水氣單胞菌gyrA83位點(diǎn)單突變檢出率明顯高于對(duì)照組[OR=4.45，95% CI（1.29，15.34），P=0.02]，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。由于parC87位點(diǎn)突變均是聯(lián)合gyrA83位點(diǎn)一起突變，無單獨(dú)突變，因此未進(jìn)行Meta分析。納入6篇文獻(xiàn)進(jìn)行g(shù)yrA83位點(diǎn)和parC87位點(diǎn)雙突變檢出率的Meta分析，異質(zhì)性檢測提示各研究間無異質(zhì)性（P=0.59，I2=0%），可采用固定模型進(jìn)行Meta分析，結(jié)果表明，耐藥組的gyrA83位點(diǎn)和parC87位點(diǎn)雙突變檢出率明顯高于對(duì)照組[OR=

9.10，95% CI（2.32，35.76），P=0.002]，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。將上述7篇納入文獻(xiàn)的gyrA83位點(diǎn)單突變和6篇納入文獻(xiàn)的gyrA83、parC87雙位點(diǎn)突變用ITC軟件進(jìn)行間接Meta分析，發(fā)現(xiàn)目前gyrA83位點(diǎn)單突變檢出率顯著高于gyrA83、parC87雙位點(diǎn)突變檢出率[OR=0.49，95% CI（0.08，3.09），P=0.008]，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

嗜水氣單胞菌的致病過程一般可分為黏附、入侵、定植、增殖、分泌毒素或攝取宿主養(yǎng)分、養(yǎng)料等過程（Maji et al.，2006；邱軍強(qiáng)等，2009）。毒力因子是通過調(diào)節(jié)自身相應(yīng)的毒力基因來適應(yīng)和滿足其功能需求，如胞外蛋白酶是在嗜水氣單胞菌的入侵過程中發(fā)揮重要作用。根據(jù)Ascencio和Wadstrom（1991）的相關(guān)研究結(jié)果可知，胞外蛋白酶能直接作用于宿主的相關(guān)器官組織，造成靶器官組織溶解或壞死，以利于病原菌入侵宿主和攝取營養(yǎng)物質(zhì)。嗜水氣單胞菌的胞外蛋白酶有較強(qiáng)的免疫原性，且具有獨(dú)立的致病作用，由其引起的癥狀與菌體引起的敗血癥相似，在細(xì)菌對(duì)宿主組織的黏附、細(xì)菌在體內(nèi)的增殖及逃避宿主的免疫應(yīng)答等過程中發(fā)揮重要作用（Buchley and Howerd，1999）。嗜水氣單胞菌分泌的外毒素主要以無活性的前體形式存在，在發(fā)揮生物學(xué)活性前須由蛋白酶將其C末端的蛋白進(jìn)行降解（Chac n et al.，2003）。熱穩(wěn)定金屬蛋白酶（altA）可直接致使機(jī)體發(fā)病，而熱敏感絲氨酸蛋白酶（ahpA）不能直接使機(jī)體致病，但有促進(jìn)其他致病因子分泌和活化外毒素前體蛋白的作用，對(duì)致病性也有重要影響（李槿年等，2000；夏昆華等，2004）。本研究的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，熱敏感抗金屬蛋白酶基因（astA）的檢出率為91.30%，高于其他6種毒力基因，進(jìn)一步證實(shí)當(dāng)前嗜水氣單胞菌入侵宿主和活化外毒素前體蛋白的主要胞外蛋白是astA，而ahpA的作用次之。嗜水氣單胞菌入侵水生動(dòng)物的重要部位是鰓和皮膚，定植和繁殖的主要部位則是腸道（陳婷婷，2014）。動(dòng)物被大量致病性嗜水氣單胞菌感染時(shí)，腸道內(nèi)的腸毒素含量會(huì)急速上升，且與細(xì)胞發(fā)生不可逆的結(jié)合，使體液損失嚴(yán)重，最終導(dǎo)致宿主死亡（方一風(fēng)等，2014）。本研究對(duì)熱敏感細(xì)胞腸毒素基因（altA）檢出率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示該基因的平均檢出率為80.42%，也間接證實(shí)嗜水氣單胞菌在腸道定植和繁殖時(shí)的過程中altA發(fā)揮了主要作用。

劉杰等（2015）用致病性嗜水氣單胞菌對(duì)黃沙鱉進(jìn)行攻毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hly+Aer+Alt+Act+ahal-ahp+型菌株對(duì)黃沙鱉的平均致死率為95.00%，hly+Aer+Alt-Act+ahal+ahp-型菌株的平均致死率為70.56%，hly+Aer-Alt+Act+ahal- ahp+型菌株的平均致死率為60.00%。在自然情況下，致病性嗜水氣單胞菌不依靠黏附素也可侵入宿主，引起病征，結(jié)合本研究對(duì)ahaI基因檢出率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，可推測黏附素不是唯一為致病性嗜水氣單胞菌提供黏附作用的因子，可能還存在其他未知的細(xì)菌黏附因子。astA可破壞宿主組織獲取營養(yǎng)，并入侵宿主或定植而引起致病，本研究的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示其檢出率最高，達(dá)91.30%，因此推測當(dāng)宿主受傷時(shí)，毒力基因astA發(fā)揮主要作用而促使嗜水氣單胞菌奪取營養(yǎng)，加快其入侵動(dòng)物機(jī)體；或直接依靠環(huán)境提供的條件長期與宿主接觸，并分泌毒素破壞宿主進(jìn)而侵入，依靠趨化性向其他被毒素破壞掉的組織移動(dòng)，引起宿主損傷范圍擴(kuò)大。這可能是嗜水氣單胞菌的侵染機(jī)制具有多樣性，隨著環(huán)境和宿主的不同，致病菌相應(yīng)選擇不同的侵染機(jī)制，具體原理有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

現(xiàn)有文獻(xiàn)中對(duì)嗜水氣單胞菌主要毒力基因的認(rèn)定也存在差異。朱大玲等（2006）認(rèn)為對(duì)嗜水氣單胞菌致病力影響最大的毒力基因是aerA和hlyA；付喬芳（2011）認(rèn)為aerA和ahpA是對(duì)菌株致病力影響最大的毒力基因，而altA、hlyA基因與致病性無明顯相關(guān)性；陳婷婷（2014）認(rèn)為aerA、ahpA和hlyA基因?qū)κ人畾鈫伟闹虏⌒杂绊戯@著，而altA、astA基因?qū)甑闹虏×τ绊戄^??；劉杰等（2015）將hlyA基因作為有毒嗜水氣單胞菌菌株的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為攜帶hlyA和actA基因，且同時(shí)攜帶有aerA、altA、ahal和ahpA 4種毒力基因中的2種或2種以上的嗜水氣單胞菌為強(qiáng)毒株?？梢?，致病性嗜水氣單胞菌的毒力主要與其攜帶和分泌出的各種致病因子密切相關(guān)。結(jié)合各毒力基因的功能及本研究對(duì)7種毒力基因檢出率（均大于50.00%）的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，嗜水氣單胞菌在遇到不同的環(huán)境和宿主時(shí)，其菌體為了更好地生長繁殖，會(huì)選擇性表達(dá)自身攜帶的毒力基因，通過調(diào)控基因表達(dá)量而侵入宿主并奪取營養(yǎng)。因此，本研究依據(jù)致病特點(diǎn)將毒力基因分為三大類，第Ⅰ類為細(xì)菌侵入宿主的主要基因，第Ⅱ類為可引起宿主死亡的主要毒力基因，第Ⅲ類為協(xié)助細(xì)菌入侵、激活外毒素蛋白前體等協(xié)助性毒力基因。其中，ahaI基因?qū)儆诘冖耦惗玖?，aerA、hlyA、actA和altA基因?qū)儆诘冖蝾惗玖?，astA和ahpA基因?qū)儆诘冖箢惗玖颉?/p>

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（或稱DNA促旋酶）和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ均是喹諾酮類的作用靶點(diǎn)，前者由gyrA和gyrB組成，后者由parC和parE組成。喹諾酮類藥物在細(xì)菌體內(nèi)能選擇性抑制在DNA合成過程中的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，從而干擾細(xì)菌DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及修復(fù)重組，達(dá)到殺滅細(xì)菌的效果（徐元宏和沈韶輝，2001）。鄭偉等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，gyrA、gyrB、parC和parE基因均有可能發(fā)生耐藥相關(guān)突變，但以gyrA和parC基因出現(xiàn)突變最常見。結(jié)合本研究納入的相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)目前針對(duì)基因變異產(chǎn)生耐藥的研究主要是gyrA83位點(diǎn)和parC87位點(diǎn)突變，但有關(guān)基因突變引起耐藥的主要突變位點(diǎn)有待進(jìn)一步探究。本研究采用Meta分析將gyrA83位點(diǎn)單突變與對(duì)照組（對(duì)喹諾酮類敏感菌株或標(biāo)準(zhǔn)菌株）進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)耐藥組的gyrA83位單突變顯著高于對(duì)照組；將parC87位點(diǎn)單突變與對(duì)照組（對(duì)喹諾酮類敏感菌株或標(biāo)準(zhǔn)菌株）進(jìn)行比較，也發(fā)現(xiàn)耐藥組的parC87位點(diǎn)單突變顯著高于對(duì)照組。同時(shí)對(duì)6篇納入文獻(xiàn)進(jìn)行g(shù)yrA83和parC87位點(diǎn)雙突變的檢出率進(jìn)行Meta分析，結(jié)果表明，耐藥組的gyrA83和parC87位點(diǎn)雙突變檢出率明顯高于對(duì)照組；而將上述7篇納入文獻(xiàn)的gyrA83位點(diǎn)單突變與6篇納入文獻(xiàn)的gyrA83、parC87雙位點(diǎn)突變進(jìn)行間接Meta分析，結(jié)果顯示目前gyrA83位點(diǎn)單突變檢出率顯著高于gyrA83、parC87雙位點(diǎn)突變檢出率，說明國內(nèi)喹諾酮類作用靶點(diǎn)的改變主要是由gyrA83位點(diǎn)單突變和gyrA83、parC87雙位點(diǎn)突變所引起。

4 結(jié)論

我國致病性嗜水氣單胞菌的分子檢測方法為：淮河以南地區(qū)以毒力基因actA和aerA為致病性強(qiáng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)，淮河以北地區(qū)以毒力基因hlyA和aerA為致病性強(qiáng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)。目前我國耐喹諾酮類嗜水氣單胞菌的基因突變位點(diǎn)主要是gyrA83單位點(diǎn)突變和gyrA83、parC87雙位點(diǎn)突變。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）