不同鎮靜深度介導PI3K/Akt信號通路對老年患者術后認知功能的影響研究

李小寶，楊志星，吳翼南，周敬民，趙志虎，劉香珠，鄒毅清，2

(1. 南京軍區福州總醫院476醫院，福建 福州 350002；2. 福建醫科大學福總臨床醫學院，福建 福州 350025)

?

論著

不同鎮靜深度介導PI3K/Akt信號通路對老年患者術后認知功能的影響研究

李小寶1，楊志星1，吳翼南1，周敬民1，趙志虎1，劉香珠1，鄒毅清1，2

(1. 南京軍區福州總醫院476醫院，福建 福州 350002；2. 福建醫科大學福總臨床醫學院，福建 福州 350025)

[摘要]目的觀察不同鎮靜深度對老年下肢矯形手術患者術后認知功能及腦脊液中PI3K/Akt信號通路的影響。方法根據不同鎮靜深度指數(CSI)，將行下肢矯形手術ASAⅠ～Ⅱ級老年患者70例分為CSI-50組35例和CSI-80組35例。在術前1 d及術后3，7 d使用術后恢復質量評估量表(PQRS)新認知評價體系評估患者的認知功能水平。利用蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測2組患者蛛網膜下腔穿刺置管成功后(t0)、插入喉罩后即刻(t1)及手術后6 h(t2)、24 h(t3)和48 h(t4)腦脊液中PI3K、Akt、pAkt、bcl、bax的濃度。結果術后2組患者認知功能均出現降低，CSI-50組變化較CSI-80組明顯；2組術后7 d MMSE評分恢復正常，而PQRS評分則顯示患者仍存在認知功能缺損；PQRS評分顯示術后POCD發生率明顯高于MMSE評分。Western blotting結果顯示，2組t1、t2、t3及t4時間點PI3K、pAkt、bcl水平均明顯低于t0時(P均<0.05)，而bax水平明顯高于t0時(P均<0.05)，且t1～t4時間點各指標水平CSI-50組均明顯低于CSI-80組(P均<0.05)。結論鎮靜深度對老年下肢矯形手術患者術后認知功能有不同程度影響，其影響機制可能與介導PI3K/Akt信號通路的標志性蛋白表達水平有關。

[關鍵詞]鎮靜深度；認知功能；術后；PI3K/Akt信號通路

認知是機體對外界事物的感知，是個體有計劃、有目的地獲取信息、解決問題及執行命令的基礎。認知功能障礙對患者所造成的影響遠遠超過了軀體功能障礙，導致其生活和社會適應性的障礙，無法獨立生活和工作，嚴重影響患者的生活質量和全面康復，并大大增加了家庭和社會的負擔[1-2]。部分患者尤其是老年患者在進行手術治療后出現中樞神經系統并發癥，表現為社交能力減弱、記憶力減退、認知能力及技巧退化，這類表現統稱為術后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)。目前認為POCD的發病機制與多種因素有關[3]，尚無統一的診斷標準。張百軍等[4]研究發現不同中腦電雙頻指數與老年患者術后認知功能的發生有關，過深的麻醉深度可能影響、威脅患者的生命安全，過淺的麻醉深度可能導致患者術中清醒，出現長期精神創傷，因此POCD的發生與麻醉深度之間的關系是目前臨床探討的熱點問題。近年研究發現 PI3K/Akt 通路通過調節中樞神經系統的凋亡和自噬管理著細胞的存活，該通路參與了神經系統的學習和記憶等多種生理功能[5-8]。因此提出設想：不同麻醉深度下POCD程度不同是否通過PI3K/Akt信號通路進行橋接？基于此，本研究擬通過觀察七氟烷不同麻醉指數(CSI)腰麻下下肢矯形手術老年患者術后認知功能及腦脊液中PI3K/Akt 信號通路中標志性蛋白的變化，以期尋找適宜的鎮靜深度以減輕老年患者術后POCD的程度，現將結果報道如下。

1臨床資料

1.1一般資料選擇2012年10月—2014年10月在福州總醫院476醫院接受下肢矯形手術的老年患者70例，男41例，女29例；年齡67～82(68.2±5.92)歲；ASAⅠ～Ⅱ級。均無認知功能障礙，簡易智能量表(MMSE)評分≥23分；無合并明顯心、腦、腎等重大臟器疾病，無精神異常史及家族史，無服用鎮靜催眠藥物史，無脊柱畸形。根據CSI將患者分為CSI-50組和CSI-80組，每組35例，2組年齡、性別、體質量、ASA分級比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，具有可比性，見表1。

表1　2組一般資料比較

1.2方法患者術前禁食12 h、禁水4 h，采用靜注咪達唑侖1 mg、1%利多卡因20 mL經腹股溝入路在神經刺激儀引導下行患肢股神經阻滯。效果確切后側臥于手術床上，患肢在上，選擇L4—5間隙，以改良Tuohy穿刺針行硬膜外穿刺成功后，使用連續腰麻導管(22G，Spinocath導管，德國Braun公司)通過Touhy針刺入蛛網膜下腔，拔出針芯后將Spinocath導管向頭側置入4 cm，見腦脊液后注入0.375%布比卡因輕比重液(0.75%布比卡因和注射用水1∶1體積混合)2.7 mL，速率0.05 mL/s，10 min后用冰塊測試溫度阻滯平面，如未達T10則追加0.5～1 mL。麻醉平面穩定在T10后，靜脈注射丙泊酚1～2 mg/kg、芬太尼1 μg/kg，CSI降至50后置入喉罩接麻醉機保留自主呼吸，分別吸入七氟烷，CSI-50組使CSI維持在50±5，CSI-80組使CSI維持在80±5。術中監測心電圖、無創血壓、脈搏氧飽和度、心率、中心靜脈壓、直接動脈壓、心排血量、外周血管阻力、肺循環阻力及CSI。手術結束時停止吸入七氟烷，靜脈注射舒芬太尼0.1 μg/kg和地塞米松5 mg，待CSI恢復至90以上時拔除喉罩。術后患者自控鎮痛用藥為舒芬太尼150 μg、格拉司瓊8 mg、納洛酮0.4 mg用生理鹽水稀釋至100 mL，背景輸注速度2 mL/h，患者自控鎮痛0.5 mL/min，鎖定時間15 min。

1.3觀察指標

1.3.1恢復質量評估量表(PQRS)評分在術前1 d及術后3 d、7 d使用PQRS新認知評價體系評估患者的認知功能，包括定向力、復述數字(正序/倒序)、回憶語語及組詞能力。以術后評分-術前評分的差值為評定標準，定向力≥0分；正序復述數字≥-2分；倒序復述數字≥-1分；回憶詞語≥-3分及組詞≥-3分。出現上述任何一項即認為出現POCD。

1.3.2MMSE量表評分該量表包括時間空間定向力、記憶力、注意力及計算力、回憶能力、語言能力，總分30分，<23分為認知功能缺陷。

1.3.3腦脊液中PI3K/Akt信號通路標志性蛋白水平將腦脊液標本以3 000 r/min 4 ℃離心10 min，收集上清。根據DAB方法對所提蛋白液進行濃度測定。以100 μL蛋白液中加入25 μL的上樣緩沖液于100 ℃金屬浴中變性。按照每泳道上樣量為50 μg蛋白計算上樣量。電泳(4%濃縮膠，12%分離膠，120 V，50 mA，1.5 h)結束后將凝膠取出，用PVDF膜轉印，遵循膠在負極膜在正極的原則，50 V，100 mA，2 h。5%脫脂奶粉液封閉2 h，TBS洗3次，每次5 min，分別加入5%脫脂奶粉按1∶1 000稀釋的抗PI3K、p-Akt、bcl、bax和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜，TBS洗3次，每次5 min，加入堿性磷酸酶標記山羊抗兔IgG(1∶2 000)室溫2 h，TBS洗3次，每次5 min。將濾膜放入配好的顯色液中顯色15～30 min，計算機掃描圖像，并由生物圖像分析系統(Bio-Rad 公司,Model Gel Doc 2000, 美國)分析處理。

2結果

2.12組認知功能評分比較2組術前1d PQRS評分及MMSE評分比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。2組術后3 d、7 d PQRS評分均明顯低于術前1 d(P均<0.05)，且各時間點PQRS評分CSI-50組均明顯低于CSI-80組 (P均<0.05)；2組術后3 d MMSE評分均明顯低于術前1 d(P均<0.05)，且CSI-50組明顯低于CSI-80組(P<0.05)，2組術后7d MMSE評分與術前1d比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2　2組不同時間點認知功能評分比較±s，分)

注：①與術前1 d比較，P<0.05；②與CSI-50組比較，P<0.05。

2.22組不同評分手段POCD發生率比較PQRS評分顯示，CSI-50組術后發生POCD 14例(40%)，CSI-80組術后發生POCD 10例(28%)；MMSE評分顯示，CSI-50組術后發生POCD 12例(34%)，CSI-80組術后發生POCD 8例(23%)。PQRS評分顯示POCD發生率明顯高于MMSE評分(P<0.05)。

2.32組PI3K/Akt信號通路標志性蛋白水平比較2組t1、t2、t3及t4時間點PI3K、pAkt、bcl水平均明顯低于t0時(P均<0.05)，而bax水平明顯高于t0時(P均<0.05)，且t1～t4時間點各指標水平CSI-50組均明顯低于CSI-80組(P<0.05)。見圖1及表3。

圖1　2組PI3K/Akt信號通路各標志性蛋白水平

時間PI3K/β-actinCSI-80組CSI-50組pAkt/β-actinCSI-80組CSI-50組bcl/β-actinCSI-80組CSI-50組bax/β-actinCSI-80組CSI-50組t01.16±0.211.15±0.181.33±0.201.27±0.191.25±0.111.30±0.140.46±0.120.35±0.16t11.03±0.15①0.93±0.20①②1.26±0.18①1.13±0.21①②1.11±0.23①1.08±0.18①②0.59±0.11①0.51±0.15①②t20.91±0.18①0.83±0.15①②1.20±0.19①1.09±0.17①②0.95±0.15①0.89±0.18①②0.76±0.20①0.68±0.11①②t30.79±0.22①0.61±0.08①②1.15±0.15①0.66±0.09①②0.75±0.12①0.46±0.10①②0.99±0.15①0.83±0.23①②t40.58±0.13①0.38±0.11①②1.08±0.17①0.43±0.11①②0.56±0.15①0.22±0.13①②1.15±0.14①0.92±0.18①②

注：①與t0比較，P<0.05；②與CSI-80組比較，P<0.05。

3討論

Bedford 于上世紀50年代首次提出老年患者術后出現癡呆的情況，而POCD的概念是近10余年才被逐漸重視。本研究使用傳統MMSE評分法進行認知功能評定顯示2組患者于術后3 d均伴有MMSE評分顯著降低，但至術后7 d 2組基本達到正常水平；而2組術后7 d PQRS評分雖均有提升，但是仍然低于術前1 d，并且PQRS評分顯示POCD發生率高于MMSE手段評估所得POCD發生率，說明雖然MMSE評分可體現術后認知功能變化，但其敏感度低于PQRS評分；同時發現不同時間點CSI-80組認知功能評分均高于CSI-50組，說明CSI為80時，術后的認知狀態好于CSI為50時。

隨著對POCD研究的逐漸深入，認為老年人發生POCD的機制與中樞神經退行性改變關系密切，而細胞凋亡是神經退行性改變的主要方式。PI3K/Akt是經典的抗凋亡信號轉導通路，它通過影響下游凋亡相關蛋白、細胞周期調節蛋白等效應分子的活化過程，在細胞的增殖、凋亡、膜泡轉運和細胞的惡性轉化等眾多病理生理過程中起重要作用。PI3K是磷脂激酶家族中的重要成員，具有特異的催化磷脂酰肌醇脂類物質的激酶作用，也是參與細胞內信號轉導的信號分子之一，功能上是蛋白激酶B活化的首要調節者。在中樞神經系統病變時被證明該通路在損傷后被激活，并可以通過多種途徑發揮抗凋亡作用[9]。PI3K/Akt信號傳導調節bcl-2家族成員的活性，PI3K依賴性的Akt的激活可以使促進細胞凋亡蛋白bad磷酸化，而抑制細胞凋亡蛋白bcl-2發揮抗凋亡作用。PI3K/Akt通路的激活還可以使促細胞凋亡蛋白bax磷酸化而失活，從而抑制細胞凋亡。另活化的Akt能夠阻止線粒體釋放細胞色素C及凋亡誘導因子，從而抑制細胞凋亡[10]。近年研究顯示，PI3K/Akt通路作為促存活信號，參與了逆轉中樞神經退行性改變的作用[11]。本研究利用Westernblotting技術檢測不同時間點腦脊液中PI3K/Akt信號通路上標志蛋白的水平變化，結果顯示不同時間點PI3K、pAkt、bcl、bax水平的確發生了變化，其中各時間點CSI-50組各標志性蛋白水平變化的趨勢較CSI-80組明顯。提示不論何種深度麻醉均可造成PI3K/Akt信號通路的改變，因此認為POCD的發生與細胞凋亡關系密切，且可能通過PI3K/Akt信號通路進行橋接，而CSI為80時對中樞神經的保護效應高于CSI為50時。

綜上所述，鎮靜深度對老年下肢矯形手術患者術后認知功能有不同程度影響，此機制可能與介導PI3K/Akt信號通路的標志性蛋白表達水平有關。

[參考文獻]

[1]陳貴珍，魯開智，王恩琴，等. 七氟醚與異丙酚對老年人腹部手術術后認知功能的影響[J]. 重慶醫學，2010，39(17)：2287-2289

[2]王延國. 七氟烷和丙泊酚麻醉對老年肺癌患者術后認知功能的影響[D]. 天津：天津醫科大學，2012

[3]黃月，任秀花，張杰文，等. A1-42單克隆抗體對阿爾茨海默病大鼠認知能力及腦組織A?和ChAT表達的影響[J]. 鄭州大學學報：醫學版，2011，46(1)：88-91

[4]張百軍，楊趙棟，鄭旻,等. 硬膜外麻醉和全身麻醉對老年骨科患者術后認知功能影響對比[J]. 浙江醫學,2015,37(7): 595-596

[5]Miyawaki T,Mashiko T,Ofengeim D,et al. Ischemic preconditioning blocks BAD translocation,Bcl-xL cleavage,and large channel activity in mitochondria of postischemic hippocampal neurons[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2008,105(12):4892-4897

[6]Bruel-Jungerman E,Vevrac A,Dufour F,et al. Inhibition of PI3K-Aktsignaling blocks exercise-mediated enhancement of adult neurogenesis and synaptic plasticity in the dentate gyrus[J]. PLoS One，2009,4(11):e7901

[7]Li L,Qu Y,Mao M,et al. The involvement of phosphoinositid 3-kinase/Akt pathway in the activation of hypoxia-inducible faetor-lalpha in the developing rat brain after hypoxia-isehemia[J]. Brain Res，2008,1197:152-158

[8]Su KH,Shyue SK,Kou YR,et al. activation of endothelial nitric oxide synthase[J]. J Cell Physiol，2011,226(12):3330-3339

[9]Koh PO. Melatonin attenuates the focal cerebral ischemic injury by inhibiting the dissociation of pBad from 14-3-3[J]. J Pineal Res，2008,44(1):101-106

[10] Koh PO,Cho GJ,Choi WS. 17beta-estradiol pretreatment prevents the global ischemic injury-induced decrease of Akt activation and bad phosphorylation in gerbils[J]. J Vet Med Sci，2006,68(10):1019-1022

[11] Zhou Y,Lekic T,Fathali N,et al. Isoflurane posttreatment reduces neonatal hypoxic-ischemic brain injury in rats by the sphingosine-1-phosphate/phosphatidylinositol-3-kinase/Akt pathway[J]. Stroke，2010,41(7):1521-1527

Study of effects of different depth of sedation mediated PI3K/AKT signaling pathway on cognitive function in elderly patients after surgery

LI Xiaobao1, YANG Zhixing1, WU Yinan1, ZHOU Jingmin1, ZHAO Zhihu1, LIU Xiangzhu1, ZOU Yiqing1,2

(1. 476 Hospital of Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command, Fuzhou 350002, Fujiang, China; 2. The Clinical Medical College of Fujian General Hospital of Fujian Medical College, Fuzhou 350025, Fuzhou, China)

Abstract:Objective It is to observe the effects of different depth of sedation on postoperative cognitive function in elderly patients with lower limbs orthopedic operation, and to discuss the influence on PI3K/AKT signal pathway in the cerebrospinal fluid. Methods 70 cases of elderly patients with lower limbs orthopedics ASA Ⅰ～Ⅱ grade were divided into CSI-50 group (35 cases) and the CSI-80 group (35 cases) according to the different depth of sedation. On 1 d before, 3 d and 7 d after operation, the new cognitive evaluation system in postoperative recovery Physician Quality Reporting System (PQRS) was used to assess the cognitive function levels of the patients. The concentrations of PI3K, AKT, pAKT, Bcl and Bax in cerebrospinal fluid were determined by Western blotting after the success of the subarachnoid puncture catheter (t0), insert a laryngeal mask immediately (t1), 6 h(t2), 24 h(t3), 48 h (t4)after operation. Results The scores of postoperative cognitive function of the patients of the two groups both reduced, and the changes of CSI-50 group were more obviously than that of CSI-80 group. The MMSE scores became normal in both groups in 7 d after operation, while the PQRS scores showed that the patients still had postoperative cognitive function dysfunction(POCD), the incidence of POCD evaluated by PQRS scores was higher than that evaluated by MMSE scores. Western blotting results showed that the levels of PI3K, pAKT, Bcl at t1, t2, t3, and t4 were higher while that of bax was lower than those at t0 (P<0.05), and every index at t1-t4 was lower in CSI-50 group than that in CSI-80 group (P<0.05). Conclusion Different depth of sedation had more or less effects on the postoperative cognitive function in elderly patients with lower limbs orthopedic operation, the impact mechanism may be related to the mediation on iconic protein expression levels of PI3K/AKT signal pathway.

Key words:different depth of sedation; cognitive function; postoperation; PI3K/AKT signaling pathway

[收稿日期]2016-01-30

[中圖分類號]R614.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)13-1369-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.13.001

[基金項目]福建省科技廳重點項目(2012Y0059)；南京軍區重點課題(13ZD38)

[作者簡介]李小寶，男，主治醫師，研究方向為危重患者圍手術期處理。[通信作者]鄒毅清，E-mail：yiqing51@163.com