中藥清毒栓對宮頸癌SiHa細胞抑制作用的影響

王艷萍　徐　靜　張麗鈺　金　哲

(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，吉林　長春　130021)

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中藥清毒栓對宮頸癌SiHa細胞抑制作用的影響

王艷萍徐靜1張麗鈺金哲2

(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，吉林長春130021)

〔摘要〕目的研究中藥清毒栓對體外培養(yǎng)的宮頸癌SiHa細胞增殖及凋亡是否具有抑制和誘導(dǎo)的作用。方法采用噻唑藍(MTT)比色實驗及吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)雙染法檢測SiHa細胞增殖及凋亡的變化及細胞遷移實驗法檢測SiHa細胞遷移數(shù)量。結(jié)果不同劑量清毒栓及保婦康栓藥物作用后各組SiHa細胞增殖數(shù)量明顯減少、凋亡率明顯增加及遷移數(shù)量明顯減少。中藥清毒栓作用于SiHa細胞48 h其抑制作用最明顯。清毒栓高劑量組分別與清毒栓中、低劑量組及正常對照組差異顯著(P<0.05);中藥清毒栓作用SiHa細胞在24、72 h時各組差異均不明顯(P>0.05)。結(jié)論清毒栓的作用可能是通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)凋亡導(dǎo)致腫瘤細胞減少對宮頸癌SiHa細胞產(chǎn)生影響。

〔關(guān)鍵詞〕清毒栓；宮頸癌；SiHa 細胞；細胞凋亡

世界范圍內(nèi)發(fā)病率在女性惡性腫瘤中排第二位的是宮頸癌〔1〕。當(dāng)前，宮頸癌是婦科腫瘤中少量已找到明確病因的腫瘤之一，其發(fā)病主要是由于人乳頭瘤病毒(HPV)感染后引發(fā)機體內(nèi)源性反應(yīng)，如激活有關(guān)癌基因、抑癌基因活性受到抑制和整個基因組機體免疫調(diào)節(jié)機制紊亂等一系列病理性改變，進而引發(fā)細胞增殖與凋亡的反常，致使正常組織發(fā)生癌變。現(xiàn)代對腫瘤發(fā)病機制的研究結(jié)論之一就是細胞凋亡受到阻礙〔2,3〕。國內(nèi)宮頸癌在臨床上的治療手段主要是手術(shù)、放療和化療，并且臨床療效是肯定的，化療藥物在抑制腫瘤細胞增殖的同時也不可避免地傷害到正常細胞組織。中藥則不同，結(jié)合中醫(yī)的整體觀念和辨證論治，達到驅(qū)邪外出的目的，毒副作用相對較小。本實驗旨在研究宮頸癌SiHa細胞在中藥清毒栓作用下其生長受到抑制的情況，并進一步探究其抑制細胞生長的可能機制。

1資料與方法

1.1一般資料人宮頸癌SiHa細胞是從中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)院基礎(chǔ)學(xué)院購買的。中藥清毒栓為北京中醫(yī)藥大學(xué)金哲教授惠贈，保婦康栓購自海南碧凱藥業(yè)有限公司(批號:Z4602258)。主要試劑與儀器有胎牛血清(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)，噻唑藍(MTT)和吖啶橙(北京鼎國昌盛生物科技有限公司)，二甲基亞砜(DMSO，北京化工廠)，溴乙啶(EB，美國Sigma公司)。熒光顯微鏡 (NiKon E-CLIPSE)；CO2培養(yǎng)箱(日本三洋電機株式會社)；超凈臺(吉林大學(xué)藥學(xué)院提供)。

1.2藥物提純清毒栓主要有莪術(shù)、紫草、黃柏等成分，用水將中藥清毒栓充分溶解，加入三氯甲烷(氯仿)混勻后的溶液倒入分液漏斗中，濃縮配制成所需濃度，4℃保存。保婦康栓主要由莪術(shù)等組成，提取方法同清毒栓。

1.3MTT 法檢測SiHa細胞增殖在SiHa細胞處于對數(shù)生長期時進行實驗，棄去上層培養(yǎng)液，加入濃度為0.25%的消化液(胰酶)進行消化并及時觀察，調(diào)整離心機的速度為1 500 r/min，離心5 min，取出離心管棄去上清液，加入培養(yǎng)液，用細胞計數(shù)板進行計數(shù)，最終調(diào)整成濃度為1×105個/ml的細胞懸液，取96孔板，每孔接種100 μl細胞懸液，接種好的板子置入 5% CO2培養(yǎng)箱孵育;細胞貼壁后加入清毒栓藥液，濃度分別為0.16，0.04，0.01 g/ml及保婦康栓藥液濃度為0.017 5 g/ml，每孔中各加入相應(yīng)的藥物20 μl。每組設(shè)5個復(fù)孔，隨機分為5個組分別是空白對照組，清毒栓高、中、低3個劑量組和保婦康栓組，再次置入5%CO2培養(yǎng)箱孵育，分別在24、48及72 h這3個時間點觀察細胞狀態(tài)并照相后進行下一步實驗。分別觀察并照相后棄去上液，每孔加入含1%胎牛血清培養(yǎng)液180 μl，加入MTT(5 mg/ml)溶液20 μl，置入CO2孵育箱培養(yǎng)4 h，吸取上層培養(yǎng)液，加DMSO 150 μl，放入振蕩器震蕩10 min，放入酶標(biāo)儀分別檢測24、48、72 h時各時間點吸光值(OD值)，記錄結(jié)果。

1.4吖啶橙(AO)/EB檢測細胞凋亡在SiHa細胞處于對數(shù)生長期時進行實驗，棄去上層培養(yǎng)液，加入濃度為0.25%的消化液(胰酶)進行消化并及時觀察，調(diào)整離心機的速度為1 500 r/min，將離心管放入離心機5 min，取出離心管棄去上清液，加入培養(yǎng)液，用細胞計數(shù)板進行計數(shù)，最終調(diào)整成濃度為1×105個/ml的細胞懸液，取6 孔培養(yǎng)板，每孔加入1 ml細胞懸液，將板子放入5%CO2培養(yǎng)箱孵育，隨機分為5組，分別為空白對照組，保婦康栓組及清毒栓高、中、低3個劑量組。待細胞貼壁后每組加入不同濃度的清毒栓藥液，分別為0.16，0.04，0.01 g/ml，保婦康濃度為0.017 5 g/ml，每孔中各加入相應(yīng)的藥物250 μl，共設(shè)置5個復(fù)孔進行觀察，藥物作用48 h后取出6孔板，向蓋玻片分別滴加AO/EB 染液各5 μl，立即使用熒光顯微鏡進行觀察并拍照。最后計算出細胞凋亡率。

1.5細胞遷移實驗檢測細胞遷移能力將直徑為3.5 mm的培養(yǎng)皿底部畫一條直線，在SiHa細胞處于對數(shù)生長期時進行實驗，棄去上層培養(yǎng)液，加入濃度為0.25%的消化液(胰酶)進行消化并及時觀察，消化后離心，調(diào)整離心機的速度為1 500 r/min，將離心管放入離心機5 min，取出離心管棄去上清液，加入培養(yǎng)液，用細胞計數(shù)板進行計數(shù)，最終調(diào)整成濃度為3×105個/ml的細胞懸液，接種于直徑為3.5 mm培養(yǎng)皿中 ，置入5% CO2孵育箱培養(yǎng)，細胞均勻長滿培養(yǎng)皿后沿直線用刮棒

刮掉直線一側(cè)細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)將培養(yǎng)皿沖洗干凈，加入培養(yǎng)液，將5個培養(yǎng)皿隨機分為空白對照組，保婦康栓組及清毒栓高、中、低3個劑量組。每組加入不同的藥物濃度，分別為0.16，0.04，0.01 g/ml，保婦康濃度為0.017 5 g/ml每孔各加入200 μl，設(shè)5個復(fù)孔，藥物作用48 h后取出培養(yǎng)皿照相觀察，并計算遷移數(shù)。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1清毒栓作用于宮頸癌SiHa細胞后對其增殖作用的影響 劑量不同，清毒栓對 SiHa 細胞的抑制作用也不同，48 h抑制作用最明顯，空白對照組與其他四組差異顯著(P<0.05)，清毒栓高濃度組與空白對照組及清毒栓中、低濃度組差異顯著(P<0.05)，而在藥物作用 SiHa 細胞24、72 h 時清毒栓各組間均無顯著差異(P>0.05)。見表1及圖1～圖3。

2.2清毒栓對 SiHa 細胞凋亡作用的影響清毒栓在高、中、低劑量下對SiHa細胞都具有一定促進細胞凋亡作用。空白對照組凋亡率(7.1%±0.017%)與保婦康栓組(54.8%±0.048%)及清毒栓低、中、高濃度組(29.2%±0.04%、33.4%±0.06%、59.6%±0.12%)差異顯著(P<0.05)，清毒栓高濃度組與清毒栓中濃度組及低濃度組細胞凋亡率差異顯著(P<0.05)。見圖4。

2.3中藥清毒栓對SiHa細胞遷移能力的影響清毒栓高、中、低濃度對SiHa細胞都具有一定抑制遷移的作用，在藥物作用48 h時，空白對照組遷移數(shù)〔(192.0±9.00)個〕與清毒栓高、中、低濃度組〔(93.7±2.51、118.0±7.00、156.7±3.51)個〕及保婦康栓組〔(98.0±5.56)個〕差異明顯(P<0.05)，清毒栓高濃度組與空白對照組清毒栓中、低濃度組細胞遷移數(shù)差異顯著(P<0.05)。見圖5。

表1清毒栓對宮頸癌SiHa細胞增殖作用的影響(OD值，n=5，x±s)

組別24h48h72h空白對照0.749±0.0382)0.389±0.0382)0.390±0.0252)保婦康組0.508±0.0691)0.171±0.0101)0.152±0.0401)2)清毒栓低濃度組0.600±0.0501)0.225±0.0151)2)0.333±0.024清毒栓中濃度組0.539±0.0141)0.198±0.0101)2)0.343±0.064清毒栓高濃度組0.516±0.1041)0.160±0.0051)0.327±0.0511)

與空白對照組比較:1)P<0.05，與清毒栓高濃度組比較：2)P<0.05

圖1　各組12 h SiHa細胞增殖情況(×20)

圖2　各組24 h SiHa細胞增殖情況(×20)

圖3　各組72 h SiHa細胞增殖情況(×20)

圖4　各組細胞凋亡情況(×20)

圖5　各組細胞遷移情況(×20)

3討論

惡性腫瘤的發(fā)生過程是極其復(fù)雜的，它可以通過很多種不同的途徑發(fā)生，惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個漫長的過程，要經(jīng)過許多不同的階段，在惡性腫瘤發(fā)展的過程中細胞可能會過度增殖，而凋亡卻可能受到抑制，這種機體的平衡失控可能是腫瘤發(fā)展的因素之一〔4〕，因此抑制腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡是治療腫瘤的方向之一。清毒栓是外用藥，給藥方法是陰道納藥，清毒栓是中藥的復(fù)方制劑，方中主要藥物包括紫草、莪術(shù)、黃柏等。對于以上單味藥物的有效成分近年來有大量研究，均通過不同方法證明其抗癌的有效性〔5,6〕。莪術(shù)行氣活血，紫草清熱解毒，涼血活血，黃柏清熱燥濕，解毒療瘡，全方立意為清熱解毒，活血化瘀，近年來關(guān)于清毒栓抑制病毒感染引起的宮頸癌的作用方面做了大批研究〔7～10〕，證實含有清毒栓的血清能修復(fù)病變的SiHa細胞，這一過程是通過調(diào)控MDM2-p53反饋環(huán)的動態(tài)平衡實現(xiàn)的。含有清毒栓的血清能調(diào)控人宮頸癌SiHa細胞的細胞周期，使細胞生長在G0～G1期就停止了，阻止細胞進入S期進行DNA復(fù)制。以上結(jié)論證明了中藥清毒栓治療宮頸癌是有效的〔11〕。MTT法檢測細胞存活和生長，已廣泛用于抗腫瘤藥物的大規(guī)模篩選，細胞毒性試驗等。

本研究結(jié)果表明，中藥清毒栓對人宮頸鱗癌SiHa細胞體外增殖可能有直接的抑制作用。中藥清毒栓可以促進人宮頸癌SiHa細胞的凋亡。

4參考文獻

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〔2014-12-29修回〕

(編輯苑云杰)

〔中圖分類號〕R737.33

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)08-1822-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.014

通訊作者：金哲(1952-)，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事宮頸腫瘤研究。

基金項目：吉林省科技發(fā)展計劃項目(20140204042YY)

1長春中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院2北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院婦科

第一作者：王艷萍(1974-)，女，副主任醫(yī)師，博士，主要從事婦科腫瘤學(xué)研究。