調節性T細胞及輔助性T細胞在慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的表達及臨床意義

陳艷蓉　肖　瑤　劉　彥　王夢然　張　建

(首都醫科大學附屬北京友誼醫院醫療保健中心內科，北京　100050)

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調節性T細胞及輔助性T細胞在慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的表達及臨床意義

陳艷蓉肖瑤劉彥王夢然張建

(首都醫科大學附屬北京友誼醫院醫療保健中心內科，北京100050)

〔摘要〕目的探討慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠調節性T細胞(Treg)、輔助性T細胞(Th17)的表達及臨床意義。方法按隨機數字法將80只大鼠隨機分為模型組和對照組各40只，分別測定兩組大鼠肺功能，包括用力肺活量(FVC)、0.3 s用力呼氣容積(FEV 0.3)、用力呼氣峰值流速(PEF)、FEV0.3/FVC以及炎性因子，包括白細胞介素(IL)-6、IL-17、IL-1β、IL-35以及IL-10水平，并檢測肺組織IL-17、FoxP3及外周血Treg水平。結果模型組大鼠日漸少動、皮毛無光澤、大便稀、呼吸急促，有咳嗽、痰鳴音和分泌物；對照組大鼠則正常活動和呼吸。模型組大鼠FEV0.3、FVC、PEF、FEV0.3/FVC較對照組顯著降低(P<0.01)；模型組大鼠血清IL-6、IL-17、IL-1β水平較對照組顯著升高，而IL-10及IL-35水平顯著降低(P<0.001)；模型組肺組織中FoxP3的相對表達量顯著低于對照組，而IL-7相對表達量顯著高于對照組(P<0.001)，且模型組外周血Treg水平顯著低于對照組(P<0.001)。結論COPD病變存在高炎性反應，與Th17和Treg表達失衡，調節功能降低，以致炎性反應進一步加重有關。

〔關鍵詞〕慢性阻塞性肺疾病；調節性T細胞；Th17細胞

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是呼吸系統中的常見病變〔1〕。調節性T細胞(Treg)屬于控制機體自身免疫反應的一類細胞亞群，與自身免疫性疾病有密切關系〔2〕。輔助性T細胞(Th17)是新發現的一種可分泌白細胞介素(IL)-17的T細胞亞群，對自身免疫病變、機體防御等方面有重要作用。Th17和Treg在體內免疫環境中具有重要的維持作用，且兩者在分化過程中能相互一致，任意一種表達失衡都可能導致局部甚至全身性異常免疫變化，導致一系列免疫性疾病、感染、腫瘤等〔3〕，本研究分析Treg、Th17在COPD模型大鼠中的表達及意義。

1材料與方法

1.1材料80只雄性大鼠，鼠齡6個月，重量170～200 g，平均(183±12)g，由大連醫科大學動物實驗中心提供，許可證號SCXK(遼)2008-2002，清潔級標準飼養。將大鼠按照編號分為模型組和對照組各40只。

1.2建模方法COPD改良法建立起動物模型，并于試驗開始的第1、14天采用6%的水合氯醛麻醉成功后，暴露大鼠氣管并注入200 μl(1 mg/ml)脂多糖(由美國Sigma公司提供，批號為20100109558)。第2天將模型大鼠放入煙室內，以香煙絲10支(紅三環牌，滁州卷煙廠生產，每支焦油含量為11 mg，尼古丁為0.8 mg)、鋸末50 g混合后點燃煙熏，1次/d，30 min/次，造模周期為28 d。

1.3方法

1.3.1觀察大鼠生長情況每天對大鼠活動情況、精神、大便、反應、呼吸系統變化(是否咳嗽、有無痰鳴音、呼吸道分泌物)等情況進行觀察和記錄。

1.3.2大鼠肺功能測定采用動物肺功能分析系統(北京貝蘭博科技有限公司，型號為AniRes2003)測定大鼠用力肺活量(FVC)、0.3 s用力呼氣容積(FEV0.3)、用力呼氣峰值流速(PEF)以及FEV0.3/FVC。測定方法：以10%的水合氯醛(0.35 ml/100 g)經大鼠腹腔注射行麻醉，成功后由經氣管插管，將大鼠放置到體描箱中，頭置于低位，連接呼吸機行機械通氣法測定肺功能。測定時采用外加壓力法使之深吸氣和深呼氣，以確保能快速、準確測定出各項肺功能指標。

1.3.3大鼠炎性因子水平檢測采用酶聯免疫吸附法測定建模28 d后血清炎性因子，包括IL-6、IL-17、IL-1β、IL-35以及IL-10水平，由經培訓的專業人員嚴格按照試劑盒操作說明進行。方法：采用包被緩沖液將IL-6、IL-17、IL-1β、IL-10及IL-35捕獲抗體(均由美國RD公司提供)稀釋為適宜濃度；各凹孔分別加入稀釋抗體100 μl，室溫條件下孵育2 h；結束后移除包被液，并采用0.05%吐溫-20洗滌緩沖液對凹孔清洗2次；再次分別加封閉液300 μl，經室溫下孵育1 h后倒出殘留液，300 μl洗滌液清洗2次；各凹孔再分別加入稀釋生物素化檢測抗體100 μl，37℃條件下孵育1 h；倒出洗滌液，連續重復3次。每凹孔增加稀釋后的堿性磷酸酶標記特異性抗體溶液100 μl，室溫下孵育1 h；倒出殘余液體后進行3次洗滌；洗滌液浸泡5min;倒出液體于各凹孔倒入洗滌液進行洗滌，連續洗滌5次；各孔加入底物200 μl；室溫下顯色30 min，后于凹孔中加入0.05 ml H2SO4，并采用酶標儀(美國Bio-TEK公司提供，型號ELX800)波長約410 mm測定IL-6、IL-17、IL-1β、IL-10及IL-35光密度(OD值)。

1.3.4大鼠肺組織IL-17、FoxP3的表達建模完成28 d后以鏈霉抗生物素蛋白-過氧化酶法進行檢測，經由專業人員根據相關試劑盒的操作說明書嚴格進行。方法：①首先制作肺組織切片：于大鼠右肺取組織以10%甲醛48 h固定，對右肺上葉和肺門組織進行沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋等常規處理后，制成5 μm厚度的切片；再對切片進行脫蠟、脫水、染色和中性樹膠封片等常規處理，后備用。②表達情況測定：將IL-17、FoxP3單克隆抗體(美國Santa Cruz公司提供，批號為SC-165)按照1∶200進行稀釋，在各肺組織切片中人選擇一張，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)0.01 mol/L代替一抗染色，作為陰性對照。在切片中選5個視野，以細胞核、細胞質中有黃色至棕褐色顆粒為陽性反應。免疫組化染色半定量測定：采用由美國Image-pro plus公司提供的專業圖像分析軟件系統對圖像進行分析，以積分光密度(IOD)來表示肺組織中IL-17、FoxP3的蛋白表達情況，IOD越高蛋白表達越高(IOD為面積密度和平均光密度的乘積)。

1.3.5大鼠外周血Treg水平檢測建模成功28 d后，取100 μl新鮮血液按照每管106個細胞分別加入1.0 μg CD25單抗(美國BD公司提供，批號132004)、0.25 μg CD4單抗(美國BD公司提供，批號110240)，避光約0.5 h后加入1 ml紅細胞裂解液，再避光約20 min。后以PBS清洗2遍，離心后除去上清液，采用流式細胞儀(美國Beckman Coulter，型號Epicsel XL)對Treg表達情況進行檢測。

1.4統計學方法采用SPSS18.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗。

2結果

2.1兩組大鼠體征觀察外觀：對照組大鼠均活潑好動，全身皮毛有光澤、食量正常，體重均漸漸增高；模型組大鼠日漸蜷伏、少動、拱背、蜷臥、食量減少，毛不具有光澤、易脫落，大便溏稀、體重與對照組相比較低。呼吸：對照組大鼠呼吸較為平穩，呼吸道內無分泌物，無痰鳴音；模型組大鼠則呼吸急促、口鼻流出明顯分泌物，不時聞及痰鳴音、咳嗽，且隨著入組時間的加長，癥狀漸漸加重。

2.2兩組大鼠肺功能指標比較模型組大鼠FEV0.3、FVC、PEF、FEV0.3/FVC較對照組顯著降低(P<0.01)，見表1。

2.3兩組大鼠炎性因子水平比較模型組大鼠血清IL-6、IL-17、IL-1β水平較對照組顯著升高，而IL-10及IL-35水平顯著降低(P<0.001)，見表2。

表1　兩組大鼠肺功能指標比較

表2　兩組大鼠模型血清炎性因子水平比較

2.4兩組肺組織中IL-7、FoxP3和外周血中Treg水平比較模型組肺組織中FoxP3的相對表達量顯著低于對照組，而IL-7相對表達量顯著高于對照組(P<0.001)，且模型組外周血Treg水平顯著低于對照組(P<0.001)，見表3。

表3　兩組大鼠模型肺組織中IL-7、FoxP3表達情況和

3討論

COPD作為一種全身性病變，不僅累及呼吸系統，而且病程進展過程中對全身器官、相關系統均有不良影響〔4〕。COPD病機較為復雜，早期研究認為巨噬細胞、中性粒細胞是導致COPD炎性反應的主要細胞，但隨著近年來研究的不斷深入已證實，T淋巴細胞導致的炎性反應以及自身免疫均是激活巨噬細胞、中性粒細胞的關鍵〔4〕。由于二氧化碳潴留、低氧以及反復性感染等導致機體長時間處于應激狀態，促進了下丘腦-垂體-腎上腺髓質軸的過度興奮，提高了胰高糖素、糖皮質激素、兒茶酚胺等分解激素的水平，胰島素釋放被抑制，進而發生胰島素抵抗(IR)，造成血糖增高現象〔5〕。這不僅增加了機體能量消耗，還對病患呼吸肌力量、免疫功能等造成損傷，引起毛細血管閉塞、肺小動脈硬化等，進而形成死腔樣通氣，肺通氣/血流失衡，氧合指數顯著降低，局部組織嚴重缺氧，最終形成惡性循環〔6〕。

研究顯示，香煙所參與的激活T細胞并介導相應免疫應答，對COPD的氣道炎性反應具有持續性進展作用〔7〕。本研究與相關文獻〔8〕報道結果一致，證實COPD大鼠模型肺功能降低后，肺組織中FoxP3表達降低，其免疫調節作用降低，難以抑制機體收到的炎性刺激，進而導致COPD肺功能持續性降低，這也可能是臨床上COPD患者出現肺氣腫的原因〔9〕。

Treg作為一組CD4T細胞亞型，以負免疫調節功能為主，可介導免疫調節、加強免疫耐受性，以維持內環境的穩定狀態。Treg表達異常與多種慢性炎性病變、自身免疫性疾病均有密切關系〔10〕。Treg細胞免疫機制主要體現在3個方面：①細胞-細胞接觸依賴性機制，也是Treg主要作用機制，CD4+CD25+Treg通過效應T細胞的該作用機制對T細胞增殖、IL-2轉錄和表達進行抑制〔11〕；②抑制性細胞因子依賴機制，目前普遍認為IL-2、IL-10等因子在Treg細胞抑制功能中有重要作用；③通過與抗原呈遞細胞來調節機體的免疫功能。王華英等〔1〕提出了Treg/Th17平衡的新理論。Th17能特異性分泌出IL-17，將中性粒細胞、巨噬細胞向炎性組織聚集，加重炎性反應。Treg則可抑制炎癥反應，以維持免疫穩定性。兩者通過相互抑制、拮抗，促使內環境維持在相對平衡的狀態〔12〕。本研究進一步證實了COPD導致炎性反應，Treg、Th17的表達明顯失衡〔13〕。COPD的肺功能與Treg、Th17表達情況密切相關，且Treg、Th17在免疫調節中有相互抑制、拮抗作用。當Treg、Th17表達失衡，機體免疫調節功能降低，則導致炎性反應加重。因此臨床檢測二者有助于針對病情制定科學、有效的治療方案，值得進一步研究。

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〔2015-06-11修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)

第一作者：陳艷蓉(1980-)，女，碩士，住院醫師，主要從事老年醫學，呼吸病學方面的研究。

〔中圖分類號〕R563

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)09-2078-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.013

通訊作者：張建(1955-)，男，主任醫師，主要從事老年病，呼吸病學方面的研究。