小檗堿增強阿霉素誘導的膀胱癌T24細胞凋亡*

陳奇彪,　詹雄宇,　呂秀秀,　陳　波,　秦曉平,　陳建帆,　黃　君,　瞿利軍，　卓育敏△

(暨南大學 1附屬第一醫院， 2醫學院病理生理學系，廣東 廣州 510632)

?

小檗堿增強阿霉素誘導的膀胱癌T24細胞凋亡*

陳奇彪1,詹雄宇1,呂秀秀2,陳波1,秦曉平1,陳建帆1,黃君1,瞿利軍1，卓育敏1△

(暨南大學1附屬第一醫院，2醫學院病理生理學系，廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 研究小檗堿對阿霉素誘導的膀胱癌T24細胞凋亡的影響及機制。方法: 將膀胱癌T24細胞分為對照組、阿霉素組、阿霉素+小檗堿組和小檗堿組。采用CCK-8試劑盒測定膀胱癌T24細胞的增殖抑制率。采用Hoechst 33258染色劑檢測細胞凋亡，同時測定caspase-3和caspase-9活性以及Bcl-2、Bax蛋白的表達。 結果: 小檗堿呈劑量和時間依賴性地促進阿霉素誘導的T24細胞凋亡。與阿霉素組比較，小檗堿+阿霉素組caspase-3、caspase-9活性和Bax蛋白的表達水平明顯增加，而Bcl-2蛋白表達水平降低。結論: 小檗堿可進一步增強阿霉素對T24細胞增殖的抑制作用，其機制與小檗堿增強阿霉素誘導的T24細胞凋亡有關。

[關鍵詞]小檗堿； 阿霉素；膀胱癌T24細胞； 細胞凋亡

非肌層浸潤性膀胱癌(non muscle-invasive bladder cancer, NMIBC)目前標準治療方案是經尿道膀胱腫瘤電切術(transurethral resection of bladder tumor, TURBT)及術后輔助膀胱內灌注化療，主要目的是減少膀胱癌患者的復發和進展[1]。臨床研究顯示膀胱灌注阿霉素(doxorubicin, DOX)可以有效預防淺表性膀胱癌術后復發及進展[2]。然而，阿霉素的臨床應用價值受限于對正常膀胱黏膜上皮的毒副作用，并且部分病人仍然復發[3]。因此，尋找一種對膀胱癌有更高療效，又能保護正常膀胱黏膜上皮的治療方法，具有十分重要的臨床意義。

小檗堿(berberine, Ber)，是一種異喹啉生物堿，已被報道具有多種藥理活性，包括抗腫瘤和心血管保護作用[4-5]。大量證據表明，小檗堿對多種類型的腫瘤細胞產生細胞毒性作用，例如結腸癌、前列腺癌和膀胱癌等[6-7]。同時，體外實驗證實小檗堿能通過誘導細胞凋亡、抑制細胞周期及細胞遷移等途徑殺滅膀胱癌細胞[8-9]。此外，Marin-Neto等[10]研究證實小檗堿具有保護和改善心臟功能的作用。還有研究發現小檗堿可減輕阿霉素引起的心臟毒性[11-12]。有趣的是，Tong等[13]發現小檗堿可促進阿霉素對人類多種癌細胞和敏感性和抗腫瘤作用。然而，小檗堿是否提高阿霉素抗膀胱癌的作用，目前尚未見報道。因此，本文觀察了小檗堿合并阿霉素對膀胱癌T24細胞生長的影響，并從分子生物學水平探討其作用機制。

材料和方法

1主要試劑

中性硫酸小檗堿購自Sigma；注射用阿霉素購自浙江海正藥業股份有限公司；RPMI-1640、0.25%胰酶、胎牛血清、青霉素和鏈霉素購自Hyclone；CCK-8試劑盒購自Dojindo；Hoechst 33258 和2’,7’-二氯熒光素雙乙酸鹽、DCFHA-DA試劑盒購自碧云天生物技術研究所；本研究所用抗體均購自CST；增強化學發光(ECL)試劑盒購自Millipore。

2細胞及培養

人類膀胱癌T24細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。T24細胞使用含5%(或10%)胎牛血清的RPMI-1640培養液，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。

3實驗方法

3.1CCK-8法檢測T24細胞增殖抑制情況將處于對數生長期的T24細胞進行消化，制成細胞懸液，以每孔1×104個細胞的密度接種于96孔板，待細胞貼壁后，分別加入不同劑量的小檗堿(0.5、1、2 μmol/L)和/或阿霉素(1 μmol/L)，每組設3個復孔(設置空白對照組)，置37 ℃、5% CO2細胞培養箱分別培養24 h及48 h后，每孔加入10 μL CCK-8，繼續培養30 min，用酶標儀測定波長450 nm處的吸光度(A)值，計算各組增殖抑制率，上述實驗重復3次以上。細胞增殖抑制率(%)=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。

3.2Hoechst 33258 染色法觀察T24細胞凋亡取對數生長期的T24細胞，按每孔1×106個細胞密度接種于6孔板中，待細胞貼壁后，分別加入小檗堿(1 μmol/L)和/或阿霉素(1 μmol/L)，作用24 h后終止培養，設置空白對照組，棄培養液后每孔加入0.5 mL固定液進行固定10min，用PBS洗滌3次，避光條件下每孔添加0.5 mL Hoechst 33258 染色液，染色10 min后置于熒光顯微鏡下觀察細胞。

3.3Western blotting 檢測T24細胞凋亡相關蛋白的表達取對數生長期的T24細胞，以按每孔1×106個細胞密度接種于6孔板中，待細胞貼壁后，更換小檗堿(1 μmol/L)和/或阿霉素(1 μmol/L)的培養液，同時設置空白對照組，作用24 h后終止培養，按照細胞蛋白分離和提取試劑盒說明書的步驟提取蛋白。BCA法檢測各組蛋白濃度，計算使用Western blotting 所需樣品濃度，分別將30 μg樣品蛋白經SDS-PAGE分離，然后電轉移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉后，加入caspase-3、caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bcl-2和Bax單克隆抗體及GAPDH內參照抗體在4 ℃環境下孵育過夜，次日TBST漂洗PVDF膜3次后，加入相應的Ⅱ抗，并室溫孵育1 h，TBST漂洗PVDF膜3次，之后經ECL發光液孵育，暗室內X光膠片成像，用Scion Image 分析軟件進行目的蛋白條帶的灰度值分析，以待測條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值表示各組相應蛋白的表達。

4統計學處理

采用SPSS 13.0統計學軟件統計分析，所有實驗結果數據采用均數±標準誤(mean±SEM)表示。多組數據間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較用SNK-q檢驗；2組數據間的比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1小檗堿增強阿霉素對膀胱癌T24細胞的增殖抑制作用

不同濃度的中性硫酸小檗堿(0.5、1、2 μmol/L)與阿霉素(1 μmol/L)作用于T24細胞24 h和48 h后，細胞密度較為稀疏，細胞之間間隙變大，更多的細胞變圓，部分細胞不貼壁或者貼壁不牢，易被消化離壁，細胞增殖受到抑制。小檗堿聯合阿霉素藥物組對T24細胞增殖的抑制效果較單用阿霉素藥物組明顯(P<0.05),且其作用具有明顯的時間依賴性(P<0.01)。而不同濃度的小檗堿聯用阿霉素，對T24細胞增殖的抑制作用無明顯差異,見圖1。

2小檗堿增強阿霉素誘導的膀胱癌T24細胞凋亡

正常細胞的細胞核呈淡藍色，較大較圓，色澤均一，形態規則，表面光滑，少有凋亡現象。單用阿霉素組內凋亡細胞的細胞核呈致密濃染或碎塊狀致密濃染，色偏白，可以看到核碎裂、核固縮、凋亡小體形成現象。小檗堿(1.0 μmol/L)聯合阿霉素作用T24細胞24 h后，相對于單用阿霉素組、空白對照組，凋亡細胞明顯增多(P<0.05)，見圖2。

Figure 1.Cell viability of T24 human bladder cancer cells treated with DOX, with or without Ber for 24 h and 48 h. Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group；##P<0.01vsDOX group.

圖1小檗堿增強阿霉素對膀胱癌T24細胞增殖的抑制作用

Figure 2.Ber enhanced DOX-induced apoptosis in T24 human bladder cancer cells. Hoechst 33258 staining indicates apoptotic morphological changes in T24 cells were observed after 24 h incubation with DOX, with or without Ber (×100). Con: control. Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control;#P<0.05 vs DOX.

圖2小檗堿增強阿霉素誘導的膀胱癌T24細胞凋亡

3小檗堿對阿霉素處理的T24細胞caspase-3和caspase-9活性，以及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

Western blotting實驗結果表明，小檗堿聯用阿霉素明顯促進T24細胞內cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax表達，同時抑制了T24細胞中Bcl-2蛋白的表達水平，見圖3、4。

Figure 3.The effects of Ber on cleaved caspase-3 and cleaved caspase-9 protein levels in DOX induced-T24 cells. Con: control. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;##P<0.01vsDOX group.

圖3小檗堿增強阿霉素誘導的膀胱癌T24細胞 cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白的表達

Figure 4.The effects of Ber on the protein expression of Bcl-2 and Bax in T24 cells treated with DOX (1.0 μmol/L) for 24 h. Con: control. Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs DOX group.

圖4小檗堿對阿霉素誘導的T24細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

討論

研究證實，小檗堿具有抗腹瀉、抗腫瘤和抗糖尿病多種藥理作用[4-5]，同時對治療慢性充血性心臟衰竭具有顯著的療效[10]。重要的是，近期研究報道小檗堿可通過誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯起抗癌和抗癌轉移作用[8-9]。此外，阿霉素仍然是目前臨床常用的抗腫瘤化療藥物，而小檗堿聯合阿霉素作用于膀胱癌T24細胞株的體外研究，目前尚未見報道。

本文采用CCK-8法發現小檗堿能增強阿霉素對膀胱癌T24細胞增殖的抑制，同時采用Hoechst 33258染色法從細胞形態學上觀察到聯合藥物組比單獨藥物組的凋亡細胞增多。

細胞凋亡是細胞在基因調控下的自殺現象，在惡性腫瘤的發生發展過程中具有重要的生物學意義，目前多種化療藥物主要通過誘導癌細胞的凋亡進而抑制腫瘤生長增殖。細胞凋亡是由caspase家族介導的級聯反應過程，而caspase-3是不同信號轉導途徑所介導的細胞凋亡過程的關鍵執行酶，是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的“公共通路”。研究證實小檗堿可通過介導caspase-9-caspase-3的內源性凋亡信號通路誘導多種腫瘤細胞的凋亡[8-9]。Western blotting檢測結果發現小檗堿聯合阿霉素誘導T24細胞中關鍵凋亡蛋白caspase-3的活性亦顯著增加，同時caspase-9的活性亦顯著增加，這提示小檗堿能夠促進阿霉素誘導T24細胞的凋亡。

Bcl-2家族成員廣泛存在于線粒體膜上，包括促凋亡蛋白(Bax，Bad)和抗凋亡蛋白(Bcl-2，Bcl-xL)，兩者之間的比例對細胞的命運起決定作用。Bax作用于線粒體上，誘發線粒體膜通透性改變，引起細胞色素C的釋放，引發caspase家族級聯反應，進而啟動細胞凋亡程序[14]。本研究表明，小檗堿聯合阿霉素作用于T24細胞后，相對于單獨藥物組、空白對照組，細胞內抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平顯著下降，而促凋亡蛋白Bax水平顯著升高，這表明小檗堿可通過調節Bcl-2家族表達變化介導caspase家族級聯反應，從而誘導膀胱癌T24細胞凋亡。

綜上所述，本研究在分子生物學水平驗證了小檗堿聯合阿霉素具有明顯抑制膀胱癌T24細胞生長的作用，其主要途徑是促進T24細胞凋亡，其機制可能與下調Bcl-2/Bax的比例，活化caspase-3有關。小檗堿聯合阿霉素作為新的抗膀胱癌治療策略具有潛在臨床價值，這為預防和治療膀胱癌、保護膀胱黏膜上皮提供新的實驗依據。

[參考文獻]

[1]Allard P, Bernard P, Fradet Y, et al. The early clinical course of primary Ta and T1 bladder cancer: a proposed prognostic index[J]. Br J Urol, 1998, 81(5):692-698.

[2]魏強,彭國輝,張劍，等. 阿霉素不同衍生物膀胱灌注對預防表淺性膀胱癌術后復發效果的系統評價[J]. 中國循證醫學雜志,2004,02(3):104-113.

[3]張亞臣,榮燁之,趙美華，等. 阿霉素中毒心肌細胞脂質過氧化及其導致的鈣超負荷的研究[J]. 中國病理生理雜志,1998,14(06):129-132.

[4]Lau CW, Yao XQ, Chen ZY, et al. Cardiovascular actions of berberine[J]. Cardiovasc Drug Rev, 2001, 19(3):234-244.

[5]Park SH, Sung JH, Chung N. Berberine diminishes side population and down-regulates stem cell-associated genes in the pancreatic cancer cell lines PANC-1 and MIA PaCa-2[J]. Mol Cell Biochem, 2014, 394(1-2):209-215.

[6]Agarwal R. Cell signaling and regulators of cell cycle as molecular targets for prostate cancer prevention by dietary agents[J]. Biochem Pharmacol, 2000, 60(8):1051-1059.

[7]Jin P, Zhang C, Li N. Berberine exhibits antitumor effects in human ovarian cancer cells[J]. Anticancer Agents Med Chem, 2015, 15(4):511-516.

[8]Yan K, Zhang C, Feng J, et al. Induction of G1cell cycle arrest and apoptosis by berberine in bladder cancer cells[J]. Eur J Pharmacol, 2011, 661(1-3):1-7.

[9]Yan L, Yan K, Kun W, et al. Berberine inhibits the migration and invasion of T24 bladder cancer cells via reducing the expression of heparanase[J]. Tumour Biol, 2013, 34(1):215-221.

[10]Marin-Neto JA, Maciel BC, Secches AL, et al. Cardiovascular effects of berberine in patients with severe congestive heart failure[J]. Clin Cardiol, 1988, 11(4):253-260.

[11]Zhao X, Zhang J, Tong N, et al. Berberine attenuates doxorubicin-induced cardiotoxicity in mice [J]. J Int Med Res, 2011, 39(5):1720-1727.

[12]Lv X, Yu X, Wang Y, et al. Berberine inhibits doxorubicin-triggered cardiomyocyte apoptosis via attenuating mitochondrial dysfunction and increasing Bcl-2 expression[J]. PLoS One, 2012, 7(10):e47351.

[13]Tong N, Zhang J, Chen Y, et al. Berberine sensitizes multiple human cancer cells to the anticancer effects of doxorubicin in vitro[J]. Oncol Lett, 2012, 3(6):1263-1267.

[14]Chang HK, Shin MS, Yang HY, et al. Amygdalin induces apoptosis through regulation of Bax and Bcl-2 expressions in human DU145 and LNCaP prostate cancer cells[J]. Biol Pharm Bull, 2006, 29(8):1597-1602.

(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Berberine promotes anti-proliferative effects of doxorubicin in T24 bladder cancer cells by enhancing apoptosis

CHEN Qi-biao1, ZHAN Xiong-yu1, Lü Xiu-xiu2, CHEN Bo1, QIN Xiao-ping1,CHEN Jian-fan1, HUANG Jun1, QU Li-jun1, ZHUO Yu-min1

(1The First Affiliated Hospital,2Department of Pathophysiology, School of Medicine, Jinan University, Guangzhou 510632, China. E-mail:tzhuoyumin@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To observe the effect of berberine (Ber) on doxorubicin (DOX)-induced apoptosis in bladder cancer T24 cells. METHODS: The cells were exposed to DOX in the presence or absence of different concentrations of Ber. The viability of the cells was determined by CCK-8 assay. The apoptosis was measured by Hoechst 33258 staining and the protein levels of cleaved caspase-3, cleaved caspase-9, Bcl-2 and Bax were detected by Western blotting.RESULTS: Ber enhanced the inhibitory effect of DOX on the viability of T24 cells and promoted DOX-induced apoptosis in T24 cells. DOX increased the protein levels of cleaved caspase-3, cleaved caspase-9 and Bax, all of which were enhanced by treatment with Ber. In contrast, Ber exposure further decreased the expression of Bcl-2 in DOX-treated T24 cells.CONCLUSION: Ber enhances the anti-proliferative effects of DOX through promoting apoptosis in bladder cancer cells.

[KEY WORDS]Berberine; Doxorubicin; Bladder cancer T24 cells; Apoptosis

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0847- 05

[收稿日期]2015- 11- 10[修回日期] 2016- 01- 18

*[基金項目]廣東省自然科學基金資助項目(No. S2013010016503)；暨南大學第一臨床醫學院科研培育專項基金資助項目(No. 2014105)

[中圖分類號]R730.23

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.013

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者Tel:020-38688516； E-mail: tzhuoyumin@126.com