化毒補(bǔ)虛方含藥血清對(duì)人肺腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的實(shí)驗(yàn)研究*

陜西中醫(yī)藥大學(xué)

全建峰　王英英　白小娜　王郁金(咸陽(yáng) 712000)

實(shí) 驗(yàn) 研 究

化毒補(bǔ)虛方含藥血清對(duì)人肺腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的實(shí)驗(yàn)研究*

陜西中醫(yī)藥大學(xué)

全建峰王英英白小娜王郁金(咸陽(yáng) 712000)

提要目的：觀察不同濃度、不同時(shí)間化毒補(bǔ)虛方誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞A549的抑制增殖作用及促進(jìn)凋亡作用。方法：應(yīng)用四氮唑藍(lán)比色法( MTT法)檢測(cè)化毒補(bǔ)虛方對(duì)人肺腺癌細(xì)胞增殖的影響，同時(shí)篩選出起有效抑制作用的濃度；并應(yīng)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化及熒光顯微鏡、透射電子顯微鏡(TEM)觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果：MTT實(shí)驗(yàn)顯示化毒補(bǔ)虛方抑制肺腺癌細(xì)胞增殖，其中50%濃度含藥血清組對(duì)A549細(xì)胞抑制作用明顯，在48 h達(dá)作用高峰；觀察細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，并可見(jiàn)凋亡小體。結(jié)論：化毒補(bǔ)虛方通過(guò)殺傷肺腺癌細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。

關(guān)鍵詞化毒補(bǔ)虛方；人肺腺癌細(xì)胞；肺腺癌；增殖及凋亡；實(shí)驗(yàn)研究；四氮唑藍(lán)比色法

肺癌是常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是肺癌的常見(jiàn)類型，約占80%，其中最常見(jiàn)的是肺腺癌，在目前的肺腺癌臨床治療中，西醫(yī)常用手術(shù)、放化療和分子靶向治療等方法；雖然取得了很大發(fā)展，但各有其治療的局限性，比如不具備手術(shù)適應(yīng)癥，化療耐藥及出現(xiàn)無(wú)法耐受的毒副作用。中醫(yī)藥已經(jīng)證明對(duì)于肺癌治療的有效性，其對(duì)于調(diào)整肌體整體平衡，改善放、化療治療的毒副反應(yīng)，提高生存時(shí)間和生存質(zhì)量具有重要意義。[1]結(jié)合多位中醫(yī)專家的醫(yī)療經(jīng)驗(yàn)所立的主方“化毒補(bǔ)虛方”，在大量NSCLC的中醫(yī)治療中取得了較好療效，因其符合攻邪化毒與補(bǔ)虛扶正并重，依據(jù)病情變化調(diào)整的思想。本實(shí)驗(yàn)就化毒補(bǔ)虛方為主要研究對(duì)象，采用四氮唑藍(lán)比色(MTT)法[1]觀察其對(duì)人肺腺癌細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制作用，并用倒置顯微鏡及熒光顯微鏡等觀察細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)一步了解化毒補(bǔ)虛方對(duì)肺腺癌生長(zhǎng)的抑制作用及可能機(jī)制。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)用大鼠A549(人肺腺癌細(xì)胞株)由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院腫瘤實(shí)驗(yàn)中心提供，Wistar大鼠購(gòu)于南京君科生物工程有限公司。

1.2樣品、試劑及儀器

1.2.1樣品：化毒補(bǔ)虛方湯劑(組成：半夏、全蝎、地龍、靈芝、山慈菇、半枝蓮、絞股藍(lán)、甘草等)，根據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”將湯劑濃縮成2.25 g/mL，用于大鼠灌胃給藥。

1.2.2主要試劑與儀器：RPMI-1640培養(yǎng)基，胎牛血清，MTT,無(wú)菌操作臺(tái)，CO2培養(yǎng)箱，低溫高速離心機(jī)，倒置相差顯微鏡，熒光顯微鏡、透射電子顯微鏡(TEM)，96孔板，酶標(biāo)板自動(dòng)讀數(shù)儀等。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1含藥血清制備對(duì)標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)置的Wistar大鼠灌胃，根據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”將湯劑濃縮成2.25 g/mL，即大鼠灌胃劑量為4.45 g/kg。每天給藥1次，連續(xù)7天，末次給藥后在無(wú)菌條件下經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置后取上清，3 000 r，30 min離心，取上清，即為含藥血清，經(jīng)56℃水浴滅活后，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，經(jīng)培養(yǎng)證明無(wú)微生物污染后，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2細(xì)胞培養(yǎng)將購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院腫瘤實(shí)驗(yàn)中心的人肺癌A549細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞長(zhǎng)滿貼壁，待細(xì)胞貼壁(約6 h后)，換培養(yǎng)液1次，至細(xì)胞長(zhǎng)成單層后(約3 d左右)進(jìn)行傳代。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，分裝新培養(yǎng)瓶中，置于37℃、飽和濕度含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中無(wú)菌培養(yǎng)。

2.3體外抗腫瘤活性測(cè)定

2.3.1四氮唑藍(lán)比色法( MTT法)：將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的A549肺腺癌細(xì)胞接種于96孔板中，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度(100%、50%、33%、25%、20%濃度)的含藥血清，對(duì)照組加入含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24、48、72 h的肺腺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%

2.3.2倒置顯微鏡及熒光顯微鏡、TEM觀察細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)：觀察對(duì)肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制最明顯濃度的細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)的變化及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，觀察是否出現(xiàn)凋亡小體、核染色質(zhì)固縮、邊集等現(xiàn)象。

2.4統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異有顯著性。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1MTT法檢測(cè)化毒補(bǔ)虛方對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響觀察100%、50%、33%、25%、20%濃度的含藥血清作用24、48、72 h后A549細(xì)胞的吸光值，25%濃度的含藥血清組的吸光值差異無(wú)顯著性，而100%、50%、33%、20%濃度的含藥血清組及對(duì)照血清組的吸光值差異有顯著性。結(jié)果見(jiàn)表1。而50%濃度含藥血清組對(duì)A549細(xì)胞抑制作用明顯，在48 h作用達(dá)高峰，不排除隨著時(shí)間延長(zhǎng)，含藥血清濃度降低，而降低含藥血清的抑制作用。結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1含藥血清不同作用時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞的影響

分組24h吸光值抑制率(%)48h吸光值抑制率(%)72h吸光值抑制率(%)20%血清組0.060±0.00814.70.141±0.01833.40.225±0.03321.025%血清組0.064±0.0158.90.214±0.065-9.4 0.197±0.00714.333%血清組0.059±0.00916.50.237±0.010-11.0 0.226±0.0111.750%血清組0.036±0.01749.20.107±0.01350.00.236±0.010-2.6 100%血清組0.049±0.00730.70.125±0.01841.50.206±0.01110.4對(duì)照血清組0.070±0.0100.0*0.212±0.0250.0*0.230±0.0110.0*

M：與實(shí)驗(yàn)組相比，*P<0.05

M：含藥血清濃度1、2、3、4、5分別為20%、25%、33%、50%、100%濃度含藥血清。

圖1含藥血清對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549抑制率

3.2實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)觀察通過(guò)倒置顯微鏡及Hoechst熒染色法對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，并可見(jiàn)凋亡小體，說(shuō)明含藥血清可能誘導(dǎo)A549的凋亡。分析：⑴倒置顯微鏡觀察：50%濃度含藥血清組細(xì)胞變小變圓，皺縮，可見(jiàn)部分脫落細(xì)胞，胞漿透光度減小，顆粒感增強(qiáng)(圖2)；對(duì)照血清組的A549細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，生長(zhǎng)舒展，無(wú)脫落，胞漿豐滿，透亮，大多呈梭形(圖3)。⑵Hoechst染色后在熒光顯微鏡下觀察：50%濃度含藥血清組細(xì)胞核大小不一，形態(tài)不規(guī)則，可見(jiàn)較多核凝集致密濃染，熒光增強(qiáng)，核固縮碎裂呈顆粒狀熒光，偶見(jiàn)凋亡碎片(圖4、圖5)；對(duì)照血清組A549細(xì)胞大小較一致，細(xì)胞壁完整，形態(tài)正常，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，核內(nèi)染色質(zhì)呈均勻藍(lán)色熒光(圖6)。

圖250%濃度含藥血清組

A549細(xì)胞變小變圓，皺縮，可見(jiàn)部分脫落細(xì)胞，胞漿透光度減小，顆粒感增強(qiáng)。(倒置顯微鏡 200×視野)

圖3對(duì)照血清組

A549無(wú)脫落，胞漿豐滿，透亮，大多呈梭形。(倒置顯微鏡200×視野)

圖450%濃度含藥血清組

形態(tài)不規(guī)則，可見(jiàn)較多核凝集致密濃染，熒光增強(qiáng)，核固縮碎裂呈顆粒狀熒光(Hoechst 400×視野)

圖550%濃度含藥血清組

形態(tài)不規(guī)則，核凝集致密濃染，熒光增強(qiáng)，可見(jiàn)凋亡碎片(Hoechst 400×視野)

圖6對(duì)照血清組

大小較一致，細(xì)胞壁完整，形態(tài)正常，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，核內(nèi)染色質(zhì)呈均勻藍(lán)色熒光(Hoechst 400×視野)

4討論

近年來(lái)，中醫(yī)藥在腫瘤防治中以其確切的療效備受人們關(guān)注，具有較好的臨床療效及應(yīng)用前景，自擬“化毒補(bǔ)虛”方是結(jié)合了多位中醫(yī)臨床腫瘤專家臨證使用經(jīng)驗(yàn)后所擬，其中半夏為肺癌治療的常用藥，半夏主要用于燥濕、化痰、止咳、抗炎、抗腫瘤作用。半夏提取物以及半夏化學(xué)成分中的半夏蛋白、半夏總生物堿、谷甾醇、半夏多糖等都具有抗腫瘤的作用。李娟等[2]對(duì)半夏類藥材提取物體外抗腫瘤的活性的研究中發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤作用與抑制S期細(xì)胞增殖和激活Caspase家族誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有很大的關(guān)系，其中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是半夏類抗腫瘤的作用機(jī)制之一。半夏蛋白中30%硫酸銨沉淀部分對(duì) Bel-7402 細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯抑制作用及促進(jìn) Bel-7402 細(xì)胞凋亡的作用。[3]掌葉半夏總蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞SKOV3的生長(zhǎng)有明顯的抑制及促凋亡作用。[4]而400、200、100 μg/mL的半夏生物堿對(duì)肝癌細(xì)胞Bel-7402有明顯的抑制作用，且隨著半夏生物堿濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)，同時(shí)半夏生物堿還可抑制肝癌細(xì)胞Bel-7402集落形成，抑制作用呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。[5]在乳腺癌細(xì)胞株 MDA-MB-231 和前列腺癌細(xì)胞株LNCaP 中，β-谷甾醇可依賴于內(nèi)源性通路加快細(xì)胞凋亡速度。[6]趙永娟等[7]研究發(fā)現(xiàn)半夏多糖對(duì)小鼠肉瘤(S180)，小鼠肝癌(H22)，小鼠艾氏腹水瘤(EAC)均有不同程度的抑制作用(P<0.05)；半夏多糖可誘導(dǎo)SH-SY5Y、PCI2細(xì)胞凋亡，對(duì)PCI2有抑制生長(zhǎng)及增殖作用(P<0.01)。 全蝎能直接抑殺癌細(xì)胞，周青等[8]學(xué)者總結(jié)全蝎的抗腫瘤作用機(jī)制主要是通過(guò)增強(qiáng)免疫功能和抑制DNA合成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤新生血管生成、直接殺傷腫瘤細(xì)胞等來(lái)實(shí)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，APBMV對(duì)人早幼粒細(xì)胞 HL-60、人肝細(xì)胞癌株SMMC-7721、人低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z、大腸癌 Lovo 細(xì)胞和人胃癌細(xì)胞株MGC-803細(xì)胞均有顯著的細(xì)胞毒性和生長(zhǎng)抑制作用,可明顯抑制細(xì)胞的集落形成,并顯示出良好的量效、時(shí)效關(guān)系。[9]地龍的現(xiàn)代藥理研究表明其有降壓、解熱鎮(zhèn)痛抗炎、促進(jìn)傷口愈合、抗血栓、平喘、增強(qiáng)免疫等多種作用，而抗腫瘤作用是其突出效用之一。地龍活性蛋白明顯提高了肌體免疫功能，包括提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和BC反應(yīng)的增強(qiáng)。與此同時(shí)，也觀察到它對(duì)骨髓造血祖細(xì)胞有明顯促進(jìn)作用，可用于腫瘤患者輔助治療。[10]靈芝有抗動(dòng)脈粥樣硬化、對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用、對(duì)臟器再灌的保護(hù)作用、調(diào)節(jié)免疫、清除自由基、抗腫瘤作用、增強(qiáng)記憶力、降血脂、保肝護(hù)肝、改善睡眠、抗病毒等藥理作用。[11]而其抗腫瘤作用表現(xiàn)在抑制腫瘤細(xì)胞增值、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡、抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移以及免疫調(diào)節(jié)等多方面。靈芝多糖通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞黏附并遷移穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮其抗腫瘤作用。[12]黃建琴等研究顯示PSG-1在體外可以明顯提高荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌NO、IL-1β和TNF-α的能力，同時(shí)提高脾淋巴細(xì)胞分泌 IL-6、IFN-γ，從而達(dá)到提高荷瘤小鼠免疫功能的作用。這些結(jié)果進(jìn)一步表明PSG-1通過(guò)體外作用于荷瘤小鼠免疫細(xì)胞，增強(qiáng)其免疫功能，實(shí)現(xiàn)抗腫瘤的作用。[13]山慈菇以復(fù)方入藥臨床上用于抗腫瘤治療取得了良好的效果。山慈菇含有秋水仙堿等多種生物堿，可提高癌細(xì)胞中的cAMP水平,抑制癌細(xì)胞有絲分裂和癌細(xì)胞的增殖。吳俊林等[14]研究顯示山慈姑能降低甲狀腺癌SW579細(xì)胞中BCL-2基因的表達(dá)水平，促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡。山慈姑提取液能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡，具有抗腫瘤作用。[15]

現(xiàn)代藥理學(xué)證明絞股藍(lán)具有抗疲勞、降血脂、降血壓、促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝以及臨床治療防衰老、傳染性肝炎、增強(qiáng)免疫、抑制腫瘤、祛痰利尿等作用。絞股藍(lán)總皂苷能降低糖尿病腎病(DN)大鼠尿蛋白，改善腎功能和足細(xì)胞相關(guān)蛋白的異常表達(dá)。[16]絞股藍(lán)多糖能使巨噬細(xì)胞數(shù)量增加,可顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能,并刺激小鼠巨噬細(xì)胞分泌NO、TNF-α和IL-1β，這可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機(jī)制之一。[17]絞股藍(lán)皂苷對(duì)肝癌細(xì)胞SMCC的作用較為敏感，而對(duì)肝癌細(xì)胞Bel7402作用不敏感。

半枝蓮抗腫瘤作用主要通過(guò)增強(qiáng)肌體免疫功能、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抗致突變作用等途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。半枝蓮提取物(SBE)具有誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞系凋亡和抑制增殖作用，作用強(qiáng)于康復(fù)新和露蜂房提取物，其機(jī)制可能與Caspase-3基因表達(dá)的上調(diào)及Bcl-2基因表達(dá)下降有關(guān)。[18]葉華等[19]研究發(fā)現(xiàn)半枝蓮多糖能明顯促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖和脾細(xì)胞分泌IL-2和TNF-α等腫瘤抑制因子，有效糾正腫瘤所引起的Thl/Th2失衡,改善肌體的免疫狀態(tài),增強(qiáng)肌體的抗腫瘤免疫功能。

以上研究顯示化毒補(bǔ)虛方中各藥物抗腫瘤作用，本實(shí)驗(yàn)以化毒補(bǔ)虛方為主要研究對(duì)象，從體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了本方對(duì)于人肺腺癌A549細(xì)胞的抑制作用，并發(fā)現(xiàn)在50%濃度含藥血清組抑制作用最明顯，并且對(duì)其形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)50%含藥血清組處理后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化并出現(xiàn)凋亡小體，抑制了肺腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)了其凋亡，為后期在肺癌治療過(guò)程中，以此為主方，針對(duì)不同病理類型及病理分期的患者予以適當(dāng)調(diào)整后運(yùn)用提供理論依據(jù)，關(guān)于化毒補(bǔ)虛方誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞凋亡調(diào)控的具體分子機(jī)制將會(huì)進(jìn)一步研究。

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(2016-01-27收稿)

Experimental Study on Function of Medicine-containing Serum of Huadu Buxu Formula on Cell Proliferation and Apoptosis of Human Pulmonary Adenocarcinoma Shaanxi University of Chinese Medicine

QUAN Jian-feng WANG Ying-ying BAI Xiao-na WANG Yu-jin

(Xianyang712000)

AbstractObjective: to observe the function of Huayu Buxu Formula in inhibiting proliferation and facilitating apoptosis of A549 of pulmonary adenocarcinoma in different density at different time. Methods: MTT with Tertrazolium Blue was taken to detect the effect of Huayu Buxu Formula on the cell proliferation, and select the proper density with inhibiting function; an inverted microscope was used to observe cell changes in form, a fluorescence microscope and a transmission electron microscope to observe changes of cell ultrastructure. Results: MTT showed the formula could inhibit the cell proliferation, which was obvious in serum of 50% density and got to the peak at 48 hours; observing the ultrastructure found that A549 changed in form obviously and the apoptotic body could be seen. Conclusion: Huadu Buxu Formula plays a anti-tumor role by killing pulmonary adenocarcinoma cells and inducing apoptosis.

Key wordsHuadu Buxu Formula; human pulmonary adenocarcinoma cells; pulmonary adenocarcinoma; proliferation and apoptosis; experimental study; MTT with Tertrazolium Blue

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5615(2016)01-0001-05

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目：No.81072757/H2708；陜西省教育廳資助項(xiàng)目：No.09JK404