綠茶中茶多酚的超聲波法提取工藝及HPLC法測(cè)定

李 慧， 李 溪, 胡 婕，周崇松

(湘南學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，湖南郴州 423000)

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綠茶中茶多酚的超聲波法提取工藝及HPLC法測(cè)定

李 慧， 李 溪, 胡 婕，周崇松*

(湘南學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，湖南郴州 423000)

摘要[目的] 優(yōu)化綠茶中茶多酚的提取工藝并測(cè)定其含量。 [方法]以浙江綠茶為原料，對(duì)超聲波輔助法提取茶多酚的條件進(jìn)行了研究，采用高效液相色譜法測(cè)定最佳條件下茶多酚含量并與酒石酸亞鐵吸光光度法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。[結(jié)果]經(jīng)過單因素和正交試驗(yàn)得出超聲波提取綠茶中茶多酚的最佳工藝為：以70%的乙醇為提取溶劑，超聲提取溫度為70 ℃，超聲處理25 min，功率為60%(150 W)，提取率為20.87%。浸提物經(jīng)過純化后采用HPLC法測(cè)定，其茶多酚含量為18.17%。[結(jié)論] 研究可為綠茶在提取工藝的改進(jìn)和茶多酚在天然解酒藥物方面的應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞茶多酚；超聲波；高效液相色譜

茶多酚又名茶單寧、茶鞣質(zhì)，是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱[1]。茶多酚具有抗氧化性、抗衰老、抗輻射、抗疾病、清除自由基等生物學(xué)功能[2]，其中清除自由基的功能使其在天然解酒藥物的研究中得到應(yīng)用[3]。

茶多酚提取工藝的研究較多[2]，傳統(tǒng)工藝通常以水或乙醇為溶劑，采用水浴加熱，保溫提取多次，然后再用有機(jī)相萃取。該方法的缺點(diǎn)是操作費(fèi)時(shí)繁瑣、溶劑消耗量大、毒性大、成本高、提取率低，在高溫下提取茶多酚易氧化變質(zhì)[2]。由于超聲波具有獨(dú)特的機(jī)械粉碎作用和空化效應(yīng)，當(dāng)其用于浸提茶多酚作業(yè)時(shí)，可以增加物料分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，提高物料分子的浸出速度和浸出數(shù)量，可在較低浸提溫度條件下獲得較高的茶多酚提取量，大大縮短了浸提時(shí)間，減少了茶多酚的氧化破壞[4-5]。筆者采用以乙醇為溶劑的超聲波浸提法優(yōu)化茶多酚提取工藝，并對(duì)比分析了酒石酸亞鐵法和高效液相色譜法[6]對(duì)測(cè)定茶多酚的影響。試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)法研究了浸提溫度、時(shí)間、功率、醇濃度對(duì)茶多酚提取率的影響，優(yōu)化了茶多酚提取工藝條件，可推動(dòng)茶多酚在天然解酒產(chǎn)品方面的應(yīng)用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及試劑。茶葉，采自浙江省杭州冠品茶葉有限公司；茶多酚對(duì)照品，天津西瑪科技有限公司,純度≥98%；無水乙醇、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、無水硫酸鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、氯仿、乙酸、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇，以上均為分析純。

1.1.2主要儀器。KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；L-7000高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.2方法茶葉樣品經(jīng)過烘干、粉碎、超聲浸提、離心分離處理，然后進(jìn)行茶多酚含量的測(cè)定[4]。試驗(yàn)對(duì)提取溫度、時(shí)間、功率、乙醇濃度4個(gè)因素分別進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝條件。

1.2.1茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。配制茶多酚濃度分別為0.016、0.018、0.020、0.022和0.024 mg/mL，以茶多酚濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2乙醇濃度對(duì)浸提率的影響。選擇料液比1∶20 g/mL，提取時(shí)間為25 min，超聲波功率為60%(150 W)，提取溫度為60 ℃，乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%，考察乙醇濃度對(duì)浸提率的影響。

1.2.3提取時(shí)間對(duì)浸提率的影響。選擇料液比1∶20 g/mL，超聲波功率為60%(150 W)，提取溫度為60 ℃，乙醇濃度為70%，提取時(shí)間分別為15、25、35、45、55 min ，考察提取時(shí)間對(duì)浸提率的影響。

1.2.4超聲提取功率對(duì)浸提率的影響。選擇料液比1∶20 g/mL，提取時(shí)間為25 min，提取溫度為60 ℃，乙醇濃度為70%，超聲波功率分別為40%、50%、60%、70%、80%，考察超聲提取功率對(duì)提取率的影響。

1.2.5提取溫度對(duì)浸提率的影響。 選擇料液比1∶20 g/mL，提取時(shí)間為25 min，乙醇濃度為70%，選擇超聲波功率為60%，提取溫度為40、50、60、70、80 ℃，考察提取溫度對(duì)提取率的影響。

1.2.6正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度、超聲波功率、超聲波提取時(shí)間、提取溫度為主要影響因素，以測(cè)定的茶多酚浸提率為指標(biāo)，進(jìn)行L16(44)正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1　L16(44)正交試驗(yàn)因素水平

1.2.7高效液相色譜測(cè)定茶多酚含量。色譜柱條件：Kromasil100-5C18(4.6×250 mm);流動(dòng)相：乙酸∶甲醇∶N,N-二甲基甲酰胺∶水=1∶1∶40∶58(V/V)；色譜柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)器：紫外可見吸收檢測(cè)器；紫外波長：280 nm。

2結(jié)果與分析

2.1茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線由圖1可見，茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：y=9.9x-0.009 6，R=0.997 1，表明在該范圍內(nèi)，茶多酚吸光值與質(zhì)量濃度有良好的線性關(guān)系。

圖1　茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of tea polyphenols

2.2超聲波提取茶多酚的單因素試驗(yàn)

2.2.1乙醇濃度對(duì)浸提率的影響。如圖2所示，當(dāng)乙醇濃度為50%～90%時(shí)，茶多酚提取率先增大再降低，乙醇濃度為80%的時(shí)候，提取率最高，但相對(duì)于70%時(shí)的提取率僅多了0.1百分點(diǎn)，影響不大，考慮到節(jié)約能耗，可以選取70%的乙醇濃度作為提取的最佳濃度。

2.2.2提取時(shí)間對(duì)浸提率的影響。如圖3所示，在試驗(yàn)的提取時(shí)間范圍內(nèi)，其對(duì)茶多酚含量的影響不是很明顯，但還是可以看出它有一個(gè)最佳值，即在25 min時(shí)的提取率相對(duì)于時(shí)間更長的效果更好。所以選擇提取時(shí)間25 min為茶多酚提取的最佳提取時(shí)間。

2.2.3超聲提取功率對(duì)浸提率的影響。如圖4所示，在超聲功率為40%～80%(100～200 W)的范圍內(nèi)，當(dāng)超聲波功率在60%(150 W)之后，茶多酚含量不再增加，而且繼續(xù)增大功率可能會(huì)導(dǎo)致有效成分中的熱敏性物質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞和活性降低。因此，選擇超聲波功率為60%(150 W)為最佳提取功率。

2.2.4提取溫度對(duì)浸提率的影響。如圖5所示，在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，茶多酚浸提率在70 ℃出現(xiàn)最大值。因此，選擇溫度為70 ℃時(shí)為提取的最佳溫度。

圖2　乙醇濃度對(duì)茶多酚提取率的影響Fig.2　Effect of ethanol concentration on the yield of tea polyphenols

圖3　提取時(shí)間對(duì)茶多酚提取率的影響Fig.3　Effect of extraction time on the yield of tea polyphenols

圖4　超聲提取功率對(duì)茶多酚提取率的影響Fig.4 　Effect of ultrasonic power on the yield of tea polyphenols

圖5　提取溫度對(duì)茶多酚提取率的影響Fig.5　Effect of temperature on the yield of tea polyphenols

2.3正交試驗(yàn)由表2可以看出，以茶多酚浸提率為指標(biāo)，4個(gè)影響因素對(duì)浸提率的影響大小依次為A、D、C、B，即超聲提取的溫度影響最大，其次是乙醇濃度和超聲功率，最后是提取的時(shí)間。正交試驗(yàn)的最優(yōu)組合為A3B1C2D4，但從成本和提取效率綜合考慮，選取出的最優(yōu)組合為A3B1C2D3，即提取溫度為70 ℃，超聲處理25 min，功率為60%(150 W)，乙醇濃度為70%。

表2　茶多酚含量測(cè)定正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4優(yōu)化工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)采用優(yōu)化工藝條件：超聲提取溫度70 ℃，超聲處理25 min，功率為60%(150 W)和乙醇濃度為70%進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果見表3。得到茶多酚平均浸提率為20.87%，RSD=0.17%，表明該工藝的重現(xiàn)性好，達(dá)到了優(yōu)化的目的。

表3茶多酚最佳工藝條件驗(yàn)證

Table 3Verification of the optimum conditions for tea polyphenols

編號(hào)No.吸光度Absorb-ance浸提率Yield%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)Relativestandarddeviation∥%平均浸提率Averageyield∥%10.15620.910.1720.8720.15420.6630.15721.04

2.5高效液相色譜測(cè)定茶多酚含量準(zhǔn)確稱取20 mg茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品，用少量乙酸乙酯溶解后定容25 mL作為茶多酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別精確移取0.7、1.3、1.9、2.5、3.1、3.7于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容。分別通過0.45 μm微孔濾膜過濾。每個(gè)樣品濃度進(jìn)樣2次，每次進(jìn)樣量10 μL，以峰面積—茶多酚濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6)。

圖6　茶多酚的HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6　HPLC standard curve of tea polyphenols

按色譜條件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，EGCG、EC、EGC與ECG混合物的保留時(shí)間分別為4.357、5.057、5.815 min。茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜見圖7。

取最佳條件所得的提取液，純化處理、減壓濃縮至50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容成儲(chǔ)備液。從儲(chǔ)備液中取2.5 mL稀釋到20 mL，稀釋液在色譜條件下進(jìn)樣3次，每次進(jìn)樣10 μL，提取液的色譜圖見圖8。求出3次積分面積的平均值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算得出提取液中茶多酚含量為18.17%。

圖7　茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜Fig.7　HPLC chromatogram of tea polyphenols

圖8　提取液的高效液相色譜Fig.8　HPLC chromatogram of extract

3結(jié)論與討論

該試驗(yàn)得出用超聲輔助法提取綠茶中茶多酚的最佳優(yōu)化工藝條件為：以70%的乙醇為提取溶劑，超聲提取溫度為70 ℃，超聲處理25min，功率為60%(150W)。采用酒石酸亞鐵分光光度計(jì)法[7]測(cè)得最佳浸提率為20.87%，與于淑池等用微波提取安吉白茶中茶多酚得率20.70%相吻合[1]；與朱鑫鑫等研究的超聲波浸提條件非常接近，兩者的微小差異可能是由于超聲波的功率不同造成的[2]；符合呂生等提出的生茶中茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過20%的觀點(diǎn)[8]。

該試驗(yàn)浸提液純化后采用HPLC法測(cè)定茶多酚的純度[9]，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品得提取產(chǎn)品中茶多酚含量為18.17%。

超聲波輔助法提取工藝極大地縮短了提取時(shí)間，且提高了浸提率，可廣泛應(yīng)用于從茶葉中提取茶多酚，從而推動(dòng)茶多酚在天然解酒產(chǎn)品制備工藝的發(fā)展。

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基金項(xiàng)目湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(13C897)；湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)及創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(湘教通[2014]248號(hào)，484)；國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(教高司函[2014]58號(hào)，8778)。

作者簡介李慧(1994- )，女，湖南攸縣人，本科生，專業(yè)：應(yīng)用化學(xué)。 *通訊作者，講師，博士，從事理論與計(jì)算化學(xué)研究。

收稿日期2016-03-22

中圖分類號(hào)S 571.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)13-080-03

The Extraction Conditions with Ultrasound and the HPLC Mensuration of Tea Polyphenols

LI Hui, LI Xi, HU Jie, ZHOU Chong-song*

(School of Chemical Biology and Environmental Engineering, Xiangnan University, Chenzhou, Hunan 423000)

Abstract[Objective] The aim was to optimize extraction technique of tea polyphenols and determine its content.[Method] Taking Zhejiang green tea as raw material, the extraction of tea polyphenols by ultrasonic assisted method was studied.The content of tea polyphenols under the optimal conditions was determined by HPLC method, and was compared with the results determined by spectrophotometry.[Result] Through single factor and orthogonal experiments the optimal conditions of soaking tea polyphenols were determined as follows:70% ethanol concentration as solvent, ultrasonicwave extraction temperature at 70 ℃, extraction time of 25 min and the ultrasonicwave power with 60%(150 W), and the yield of tea polyphenols was 20.87%.The content of tea polyphenols was 18.17% by HPLC method after purification.[Conclusion] The study can provide a reference for improvement of green tea in extraction technique and application of tea polyphenols in natural hangover drug.

Key wordsTea polyphenols; Ultrasonic; HPLC