苦蕎發芽過程中γ—氨基丁酸的富集及其他生理指標的變化

朱云輝++段元鋒++郭元新

摘要：研究苦蕎在發芽期間γ-氨基丁酸（GABA）的富集及相關生理指標的變化，并對各指標間的相關性進行了分析。結果表明：隨著發芽時間的延長，苦蕎生長加快，呼吸作用增強，可溶性糖、還原糖、游離氨基酸含量增加；可溶性蛋白、干物質含量下降，GABA含量在發芽4 d時達到最高值，谷氨酸脫羧酶（GAD）活力呈現先增加后降低的趨勢。相關性分析表明：發芽苦蕎GABA的富集量與呼吸強度（r=0.794）呈顯著正相關（P<0.05），與游離氨基酸含量（r=0.963）、GAD活力（r=0.879）呈極顯著正相關（P<0.01），與可溶性蛋白含量（r=-0.769）呈顯著負相關（P<0.05）。

關鍵詞：發芽苦蕎；γ-氨基丁酸（GABA）；富集；生理指標；相關性

中圖分類號： S517.01文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0332-04

苦蕎[Fagopyrum Tataricum （L.） Gaertn]是一種蓼科蕎麥屬雙子葉植物，別稱韃靼蕎麥、烏麥，是我國傳統的優勢小雜糧，在我國西北、西南等地區有廣泛種植[1]。研究表明，苦蕎中的蛋白質、維生素、脂肪及礦物質含量高于大米、高粱、小麥、玉米等農作物，且含有其他禾谷類糧食所沒有的蕓香苷等黃酮類物質及葉綠素[2]。由于苦蕎還含有蛋白酶抑制劑[3]、植酸[4]和過敏蛋白[5]等抗營養因子，其營養價值還有待改善。有研究報道：發芽處理可消解或顯著降低苦蕎中的抗營養成分[3，6]；通過控制發芽條件，還能夠富集γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，簡稱GABA）等功能性成分[7-8]。

GABA是1種4碳非蛋白質氨基酸，天然分布于真核、原核生物中，主要存在于哺乳動物的腦組織、脊髓中，是哺乳動物中樞系統中1種非常有效的神經遞質，參與多種代謝活動，具有重要的生理功能[9-10]。研究證實，GABA具有降血壓、調節心率失常、鎮定安神、調節激素分泌、預防肥胖和改善腦機能等作用[11-12]，因此，開發富含GABA的食品倍受重視。植物中GABA的合成主要通過GABA支路，此途徑的限速酶為谷氨酸脫羧酶（GAD，EC 4.1.1.15）[9，13]。本研究分析了苦蕎在正常發芽過程中GABA富集、谷氨酸脫羧酶（GAD）活力、呼吸強度、糖類和蛋白質等生理指標的變化，探討其相互關系，以期為生產富含GABA的苦蕎功能性食品提供理論支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗用苦蕎品種：榆6-21，千粒質量22.4 g，2013年秋產自中國內蒙古自治區，購買后于-20 ℃冰箱貯存備用。

1.2試驗試劑

GABA標準品（純度≥99.9%）、對二甲氨基苯磺酰氯（DABS-CI，99%），購自美國Sigma公司。乙腈為色譜純，其他化學試劑均為分析純。

1.3主要儀器設備

LHP-160型智能恒溫恒濕培養箱，上海三發科學儀器有限公司；Agilent 1200液相色譜儀，安捷倫公司；UV-1800紫外分光光度計，蘇州島津公司；KDC-160HR高速冷凍離心機，合肥科大創新股份有限公司；GZX-9076MBE型數顯鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SGD-Ⅳ全自動還原糖自動測定儀，山東省科學院生物研究所。

1.4發芽試驗

取30 g苦蕎種子用去離子水清洗后，用1%次氯酸鈉溶液消毒15 min，再用去離子水沖洗至pH值中性，在去離子水中于30 ℃浸泡4 h后，放入鋪有2層濾紙的直徑為9 cm培養皿中，在每個培養皿中放置約100粒種子，然后放入生化培養箱中于30 ℃暗發芽，發芽濕度為85%～90%，其間每8 h噴去離子水1次，保持種子濕潤。分別培養0、1、2、3、4、5、6 d后取樣，清洗后用吸水紙吸干水分，一部分用于測定芽長、GAD活性等生理指標，其余樣品采用真空冷凍干燥后去殼粉碎、過80目篩測定GABA、糖類、氨基酸等物質含量。

1.5測定方法

干物質含量：用烘干恒質量法測定；芽長：隨機選取30粒發芽苦蕎籽粒，用游標卡尺測定其芽長；呼吸強度：用小籃子法測定[14]，以鮮質量計算CO2產生量；還原糖含量：用還原糖自動測定儀測定干質量含量；可溶性糖含量：用苯酚硫酸法測定干質量含量[14]；可溶性蛋白質含量：用考馬斯亮藍G-250法測定干質量含量，以牛血清白蛋白為標準[14]；游離氨基酸含量：用茚三酮溶液顯色法測定干質量含量[14]；GAD活力：參照Zhang等方法[15]測定鮮質量活力；GABA含量：參考Guo等的方法[16]測定。

1.6統計分析

試驗設3次重復，結果以“ x±s”表示。方差分析、相關性分析采用SPSS（version 16.0，Inc.，Chicago，IL，USA）軟件，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2結果與分析

2.1苦蕎發芽過程中芽長的變化

如圖1所示，苦蕎芽長隨著發芽時間的延長而不斷增加：發芽1 d苦蕎芽長增長緩慢，僅為3.32 mm；發芽2 d后增長明顯加快；發芽6 d后，芽長達到97.36 mm。

2.2苦蕎發芽過程中干物質含量的變化

隨著發芽時間的延長，干物質含量呈極顯著的下降趨勢（P<0.01）。發芽6 d時，干物質含量為24.37%，比0 d下降了63.61%（圖2）；苦蕎發芽時間過長，會大量消耗干物質，從而影響發芽苦蕎的品質。

2.3苦蕎發芽過程中呼吸強度的變化

如圖3可見，在30 ℃下，苦蕎的呼吸強度隨著發芽時間的延長不斷增強：發芽1 d內，苦蕎呼吸強度增長緩慢，為 0.25 mg/（g·h），僅比0 d增加了30.69%；隨后快速提升，發芽6 d時達到1.20 mg/（g·h），是0 d的6.35倍。

2.4苦蕎發芽過程中還原糖含量的變化

圖4顯示，在苦蕎發芽的前3 d，還原糖含量增長緩慢，發芽3 d僅為7.74 mg/g，是0 d的3.75倍；之后顯著提升（P<0.01），在發芽5 d達到最大值，為19.88 mg/g，是0 d的9.65倍；隨后緩慢下降。

2.5苦蕎發芽過程中可溶性糖含量的變化

如圖5所示，在苦蕎發芽0～2 d內，可溶性糖含量變化不顯著；2～4 d內可溶性糖含量急劇上升，發芽4 d時達到最大值，為46.89 mg/g，為0 d的2.51倍；4 d后呈現下降趨勢。

2.6苦蕎發芽過程中可溶性蛋白含量的變化

由圖6可知，發芽前2 d，苦蕎中可溶性蛋白含量顯著下降（P<0.05），在發芽2 d時達到3.67 mg/g，較0 d下降了10.73%。隨后可溶性蛋白呈極顯著下降的趨勢（P<0.01）；在6 d時含量為0.97 mg/g，較0 d降低了77.82%。

2.7苦蕎發芽過程中游離氨基酸含量的變化

苦蕎中游離氨基酸的含量隨著發芽時間的延長呈現先增加后減少的趨勢，在發芽4 d達到最高值，為578.85 μg/g，是0 d的3.74倍；隨后緩慢下降（圖7）。

2.8苦蕎發芽過程中GAD活力的變化

如圖8所示，GAD活力在發芽后急劇提升，在發芽3 d達到最高值，為40.79 U/g，是0 d的2.28倍；4 d后極顯著下降（P<0.01），在發芽6 d酶活力降至26.36 U/g。GAD作為GABA合成途徑的限速酶，其活力的提升有助于GABA的富集。

2.9苦蕎發芽過程中GABA含量的變化

如圖9所示，GABA含量隨著發芽時間的延長呈現極顯著的增加趨勢（P<0.01），并在發芽4d達到最高值，為187.39 μg/g，比0 d增加85.35%；發芽4 d后GABA含量緩慢下降。由此可見，苦蕎發芽4 d有利于GABA的富集。

2.10發芽苦蕎GABA含量與生理生化指標的相關性分析

相關性分析（表1）表明，發芽苦蕎GABA的富集量與呼吸強度（r=0.794）呈顯著正相關（P<0.05）；與游離氨基酸含量（r=0.963）、GAD活力（r=0.879）呈現極顯著正相關（P<0.01）；與可溶性蛋含量（r=-0.769）呈顯著負相關（P<0.05）。

3討論

已有報道證明，植物中的GABA合成主要來自GABA支路中由GAD催化的不可逆的α-谷氨酸脫羧反應[9]。植物種子經浸泡發芽后，GAD大量合成，GABA量隨之增加[17]。本研究表明：GABA富集量與GAD活力呈極顯著正相關（P<0.01），苦蕎在發芽前4 d，GABA富集量、GAD活力均不斷提升；發芽4 d后，GAD活力下降，GABA含量也呈下降趨勢。

發芽過程實質上是一個酶促反應的過程，種子經浸泡發芽后，呼吸速率加快，淀粉酶和蛋白酶等水解酶被迅速激活，貯藏物質降解，干物質含量下降，為呼吸、GABA合成等生理活動提供了充足的底物[18-20]。苦蕎在發芽過程中，淀粉被分解為小分子糖類，還原糖和可溶性糖含量不斷升高，但在發芽4～5 d后呈現下降趨勢，這可能是由于淀粉被分解的速率低于還原糖、可溶性糖消耗的速率所致。可溶性蛋白含量與游離氨基酸含量呈顯著負相關，且均與呼吸強度呈現極顯著相關性，隨著苦蕎的生長，蛋白酶活性增強，呼吸強度提升，其氮代謝隨之加劇，大分子的蛋白質分解為游離氨基酸，其組成更表1苦蕎發芽過程中生理活性和GABA等物質含量的相關性分析結果

指標芽長干物質含量呼吸強度可溶性糖含量可溶性蛋白含量游離氨基酸含量GAD活力干物質含量-0.969**呼吸強度0.945**-0.979**可溶性糖含量-0.642-0.7040.826*還原糖含量0.937**-0.937**0.960**0.824*可溶性蛋白含量-0.949**0.963**-0.992**—游離氨基酸含量0.733-0.867*0.902**—-0.870*GAD活力0.220-0.4340.482—-0.4180.790*GABA活力0.595-0.7500.794*—-0.769*0.963**0.879**注：“*”表示在0.05水平上顯著，“**”表示在0.01水平上顯著，“—”表示不存在或無需關注其相關性。

加合理，提高了種子的營養價值。研究者們對發芽的大豆[21]、糙米[22]和蠶豆[23]的研究均表明，GABA的富集量與氨基酸含量呈顯著正相關。在本研究中，苦蕎的GABA含量與游離氨基酸呈現極顯著的正相關；此外，大分子的可溶性蛋白不斷下降，與GABA含量呈顯著負相關，這些變化有利于 GABA 的富集。

4結論

苦蕎發芽過程中各生理指標均發生了顯著的變化（P<0.05）?？嗍w芽長不斷生長，呼吸作用加快，干物質含量降低，還原糖含量在發芽5 d達到最高值，隨后不斷下降，可溶性糖含量先下降后上升再下降，可溶性蛋白含量不斷下降，游離氨基酸含量不斷增加并在發芽4 d達到最高值。GAD活力呈現先增加后降低的趨勢，GAD活力的提升促進了GABA的富集，在發芽4 d時GABA含量達到最高值，為187.39 μg/g，與發芽0 d相比增加了85.35%。相關性分析表明：發芽苦蕎GABA的富集量與呼吸強度（r=0.794）呈顯著正相關（P<0.05），與游離氨基酸含量（r=0.963）、GAD活力（r=0.879）呈極顯著正相關（P<0.01），與可溶性蛋白含量（r=-0769）呈顯著負相關（P<0.05）。

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