苦蕎發(fā)芽過(guò)程中γ—氨基丁酸的富集及其他生理指標(biāo)的變化

朱云輝++段元鋒++郭元新

摘要：研究苦蕎在發(fā)芽期間γ-氨基丁酸（GABA）的富集及相關(guān)生理指標(biāo)的變化，并對(duì)各指標(biāo)間的相關(guān)性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，苦蕎生長(zhǎng)加快，呼吸作用增強(qiáng)，可溶性糖、還原糖、游離氨基酸含量增加；可溶性蛋白、干物質(zhì)含量下降，GABA含量在發(fā)芽4 d時(shí)達(dá)到最高值，谷氨酸脫羧酶（GAD）活力呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。相關(guān)性分析表明：發(fā)芽苦蕎GABA的富集量與呼吸強(qiáng)度（r=0.794）呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與游離氨基酸含量（r=0.963）、GAD活力（r=0.879）呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與可溶性蛋白含量（r=-0.769）呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。

關(guān)鍵詞：發(fā)芽苦蕎；γ-氨基丁酸（GABA）；富集；生理指標(biāo)；相關(guān)性

中圖分類(lèi)號(hào)： S517.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0332-04

苦蕎[Fagopyrum Tataricum （L.） Gaertn]是一種蓼科蕎麥屬雙子葉植物，別稱(chēng)韃靼蕎麥、烏麥，是我國(guó)傳統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)小雜糧，在我國(guó)西北、西南等地區(qū)有廣泛種植[1]。研究表明，苦蕎中的蛋白質(zhì)、維生素、脂肪及礦物質(zhì)含量高于大米、高粱、小麥、玉米等農(nóng)作物，且含有其他禾谷類(lèi)糧食所沒(méi)有的蕓香苷等黃酮類(lèi)物質(zhì)及葉綠素[2]。由于苦蕎還含有蛋白酶抑制劑[3]、植酸[4]和過(guò)敏蛋白[5]等抗?fàn)I養(yǎng)因子，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值還有待改善。有研究報(bào)道：發(fā)芽處理可消解或顯著降低苦蕎中的抗?fàn)I養(yǎng)成分[3，6]；通過(guò)控制發(fā)芽條件，還能夠富集γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，簡(jiǎn)稱(chēng)GABA）等功能性成分[7-8]。

GABA是1種4碳非蛋白質(zhì)氨基酸，天然分布于真核、原核生物中，主要存在于哺乳動(dòng)物的腦組織、脊髓中，是哺乳動(dòng)物中樞系統(tǒng)中1種非常有效的神經(jīng)遞質(zhì)，參與多種代謝活動(dòng)，具有重要的生理功能[9-10]。研究證實(shí)，GABA具有降血壓、調(diào)節(jié)心率失常、鎮(zhèn)定安神、調(diào)節(jié)激素分泌、預(yù)防肥胖和改善腦機(jī)能等作用[11-12]，因此，開(kāi)發(fā)富含GABA的食品倍受重視。植物中GABA的合成主要通過(guò)GABA支路，此途徑的限速酶為谷氨酸脫羧酶（GAD，EC 4.1.1.15）[9，13]。本研究分析了苦蕎在正常發(fā)芽過(guò)程中GABA富集、谷氨酸脫羧酶（GAD）活力、呼吸強(qiáng)度、糖類(lèi)和蛋白質(zhì)等生理指標(biāo)的變化，探討其相互關(guān)系，以期為生產(chǎn)富含GABA的苦蕎功能性食品提供理論支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用苦蕎品種：榆6-21，千粒質(zhì)量22.4 g，2013年秋產(chǎn)自中國(guó)內(nèi)蒙古自治區(qū)，購(gòu)買(mǎi)后于-20 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗(yàn)試劑

GABA標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.9%）、對(duì)二甲氨基苯磺酰氯（DABS-CI，99%），購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。乙腈為色譜純，其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.3主要儀器設(shè)備

LHP-160型智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；Agilent 1200液相色譜儀，安捷倫公司；UV-1800紫外分光光度計(jì)，蘇州島津公司；KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)，合肥科大創(chuàng)新股份有限公司；GZX-9076MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SGD-Ⅳ全自動(dòng)還原糖自動(dòng)測(cè)定儀，山東省科學(xué)院生物研究所。

1.4發(fā)芽試驗(yàn)

取30 g苦蕎種子用去離子水清洗后，用1%次氯酸鈉溶液消毒15 min，再用去離子水沖洗至pH值中性，在去離子水中于30 ℃浸泡4 h后，放入鋪有2層濾紙的直徑為9 cm培養(yǎng)皿中，在每個(gè)培養(yǎng)皿中放置約100粒種子，然后放入生化培養(yǎng)箱中于30 ℃暗發(fā)芽，發(fā)芽濕度為85%～90%，其間每8 h噴去離子水1次，保持種子濕潤(rùn)。分別培養(yǎng)0、1、2、3、4、5、6 d后取樣，清洗后用吸水紙吸干水分，一部分用于測(cè)定芽長(zhǎng)、GAD活性等生理指標(biāo)，其余樣品采用真空冷凍干燥后去殼粉碎、過(guò)80目篩測(cè)定GABA、糖類(lèi)、氨基酸等物質(zhì)含量。

1.5測(cè)定方法

干物質(zhì)含量：用烘干恒質(zhì)量法測(cè)定；芽長(zhǎng)：隨機(jī)選取30粒發(fā)芽苦蕎籽粒，用游標(biāo)卡尺測(cè)定其芽長(zhǎng)；呼吸強(qiáng)度：用小籃子法測(cè)定[14]，以鮮質(zhì)量計(jì)算CO2產(chǎn)生量；還原糖含量：用還原糖自動(dòng)測(cè)定儀測(cè)定干質(zhì)量含量；可溶性糖含量：用苯酚硫酸法測(cè)定干質(zhì)量含量[14]；可溶性蛋白質(zhì)含量：用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定干質(zhì)量含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)[14]；游離氨基酸含量：用茚三酮溶液顯色法測(cè)定干質(zhì)量含量[14]；GAD活力：參照Z(yǔ)hang等方法[15]測(cè)定鮮質(zhì)量活力；GABA含量：參考Guo等的方法[16]測(cè)定。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果以“ x±s”表示。方差分析、相關(guān)性分析采用SPSS（version 16.0，Inc.，Chicago，IL，USA）軟件，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2結(jié)果與分析

2.1苦蕎發(fā)芽過(guò)程中芽長(zhǎng)的變化

如圖1所示，苦蕎芽長(zhǎng)隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加：發(fā)芽1 d苦蕎芽長(zhǎng)增長(zhǎng)緩慢，僅為3.32 mm；發(fā)芽2 d后增長(zhǎng)明顯加快；發(fā)芽6 d后，芽長(zhǎng)達(dá)到97.36 mm。

2.2苦蕎發(fā)芽過(guò)程中干物質(zhì)含量的變化

隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，干物質(zhì)含量呈極顯著的下降趨勢(shì)（P<0.01）。發(fā)芽6 d時(shí)，干物質(zhì)含量為24.37%，比0 d下降了63.61%（圖2）；苦蕎發(fā)芽時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)大量消耗干物質(zhì)，從而影響發(fā)芽苦蕎的品質(zhì)。

2.3苦蕎發(fā)芽過(guò)程中呼吸強(qiáng)度的變化

如圖3可見(jiàn)，在30 ℃下，苦蕎的呼吸強(qiáng)度隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增強(qiáng)：發(fā)芽1 d內(nèi)，苦蕎呼吸強(qiáng)度增長(zhǎng)緩慢，為 0.25 mg/（g·h），僅比0 d增加了30.69%；隨后快速提升，發(fā)芽6 d時(shí)達(dá)到1.20 mg/（g·h），是0 d的6.35倍。

2.4苦蕎發(fā)芽過(guò)程中還原糖含量的變化

圖4顯示，在苦蕎發(fā)芽的前3 d，還原糖含量增長(zhǎng)緩慢，發(fā)芽3 d僅為7.74 mg/g，是0 d的3.75倍；之后顯著提升（P<0.01），在發(fā)芽5 d達(dá)到最大值，為19.88 mg/g，是0 d的9.65倍；隨后緩慢下降。

2.5苦蕎發(fā)芽過(guò)程中可溶性糖含量的變化

如圖5所示，在苦蕎發(fā)芽0～2 d內(nèi)，可溶性糖含量變化不顯著；2～4 d內(nèi)可溶性糖含量急劇上升，發(fā)芽4 d時(shí)達(dá)到最大值，為46.89 mg/g，為0 d的2.51倍；4 d后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

2.6苦蕎發(fā)芽過(guò)程中可溶性蛋白含量的變化

由圖6可知，發(fā)芽前2 d，苦蕎中可溶性蛋白含量顯著下降（P<0.05），在發(fā)芽2 d時(shí)達(dá)到3.67 mg/g，較0 d下降了10.73%。隨后可溶性蛋白呈極顯著下降的趨勢(shì)（P<0.01）；在6 d時(shí)含量為0.97 mg/g，較0 d降低了77.82%。

2.7苦蕎發(fā)芽過(guò)程中游離氨基酸含量的變化

苦蕎中游離氨基酸的含量隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，在發(fā)芽4 d達(dá)到最高值，為578.85 μg/g，是0 d的3.74倍；隨后緩慢下降（圖7）。

2.8苦蕎發(fā)芽過(guò)程中GAD活力的變化

如圖8所示，GAD活力在發(fā)芽后急劇提升，在發(fā)芽3 d達(dá)到最高值，為40.79 U/g，是0 d的2.28倍；4 d后極顯著下降（P<0.01），在發(fā)芽6 d酶活力降至26.36 U/g。GAD作為GABA合成途徑的限速酶，其活力的提升有助于GABA的富集。

2.9苦蕎發(fā)芽過(guò)程中GABA含量的變化

如圖9所示，GABA含量隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)極顯著的增加趨勢(shì)（P<0.01），并在發(fā)芽4d達(dá)到最高值，為187.39 μg/g，比0 d增加85.35%；發(fā)芽4 d后GABA含量緩慢下降。由此可見(jiàn)，苦蕎發(fā)芽4 d有利于GABA的富集。

2.10發(fā)芽苦蕎GABA含量與生理生化指標(biāo)的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析（表1）表明，發(fā)芽苦蕎GABA的富集量與呼吸強(qiáng)度（r=0.794）呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；與游離氨基酸含量（r=0.963）、GAD活力（r=0.879）呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)（P<0.01）；與可溶性蛋含量（r=-0.769）呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。

3討論

已有報(bào)道證明，植物中的GABA合成主要來(lái)自GABA支路中由GAD催化的不可逆的α-谷氨酸脫羧反應(yīng)[9]。植物種子經(jīng)浸泡發(fā)芽后，GAD大量合成，GABA量隨之增加[17]。本研究表明：GABA富集量與GAD活力呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），苦蕎在發(fā)芽前4 d，GABA富集量、GAD活力均不斷提升；發(fā)芽4 d后，GAD活力下降，GABA含量也呈下降趨勢(shì)。

發(fā)芽過(guò)程實(shí)質(zhì)上是一個(gè)酶促反應(yīng)的過(guò)程，種子經(jīng)浸泡發(fā)芽后，呼吸速率加快，淀粉酶和蛋白酶等水解酶被迅速激活，貯藏物質(zhì)降解，干物質(zhì)含量下降，為呼吸、GABA合成等生理活動(dòng)提供了充足的底物[18-20]?？嗍w在發(fā)芽過(guò)程中，淀粉被分解為小分子糖類(lèi)，還原糖和可溶性糖含量不斷升高，但在發(fā)芽4～5 d后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能是由于淀粉被分解的速率低于還原糖、可溶性糖消耗的速率所致?？扇苄缘鞍缀颗c游離氨基酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)，且均與呼吸強(qiáng)度呈現(xiàn)極顯著相關(guān)性，隨著苦蕎的生長(zhǎng)，蛋白酶活性增強(qiáng)，呼吸強(qiáng)度提升，其氮代謝隨之加劇，大分子的蛋白質(zhì)分解為游離氨基酸，其組成更表1苦蕎發(fā)芽過(guò)程中生理活性和GABA等物質(zhì)含量的相關(guān)性分析結(jié)果

指標(biāo)芽長(zhǎng)干物質(zhì)含量呼吸強(qiáng)度可溶性糖含量可溶性蛋白含量游離氨基酸含量GAD活力干物質(zhì)含量-0.969**呼吸強(qiáng)度0.945**-0.979**可溶性糖含量-0.642-0.7040.826*還原糖含量0.937**-0.937**0.960**0.824*可溶性蛋白含量-0.949**0.963**-0.992**—游離氨基酸含量0.733-0.867*0.902**—-0.870*GAD活力0.220-0.4340.482—-0.4180.790*GABA活力0.595-0.7500.794*—-0.769*0.963**0.879**注：“*”表示在0.05水平上顯著，“**”表示在0.01水平上顯著，“—”表示不存在或無(wú)需關(guān)注其相關(guān)性。

加合理，提高了種子的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。研究者們對(duì)發(fā)芽的大豆[21]、糙米[22]和蠶豆[23]的研究均表明，GABA的富集量與氨基酸含量呈顯著正相關(guān)。在本研究中，苦蕎的GABA含量與游離氨基酸呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)；此外，大分子的可溶性蛋白不斷下降，與GABA含量呈顯著負(fù)相關(guān)，這些變化有利于 GABA 的富集。

4結(jié)論

苦蕎發(fā)芽過(guò)程中各生理指標(biāo)均發(fā)生了顯著的變化（P<0.05）?？嗍w芽長(zhǎng)不斷生長(zhǎng)，呼吸作用加快，干物質(zhì)含量降低，還原糖含量在發(fā)芽5 d達(dá)到最高值，隨后不斷下降，可溶性糖含量先下降后上升再下降，可溶性蛋白含量不斷下降，游離氨基酸含量不斷增加并在發(fā)芽4 d達(dá)到最高值。GAD活力呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，GAD活力的提升促進(jìn)了GABA的富集，在發(fā)芽4 d時(shí)GABA含量達(dá)到最高值，為187.39 μg/g，與發(fā)芽0 d相比增加了85.35%。相關(guān)性分析表明：發(fā)芽苦蕎GABA的富集量與呼吸強(qiáng)度（r=0.794）呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與游離氨基酸含量（r=0.963）、GAD活力（r=0.879）呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與可溶性蛋白含量（r=-0769）呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。

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