法醫(yī)學常用15個STR基因座的突變分析

邱平明　　陳玲★　　余嘉欣　　陸慧潔　　牛牧斐　　劉超,2

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法醫(yī)學常用15個STR基因座的突變分析

邱平明1陳玲1★余嘉欣1陸慧潔1牛牧斐1劉超1,2

［摘要］目的觀察Sinofiler系統(tǒng)15個短串聯(lián)重復序列（short tandem repeat，STR）基因座的突變現(xiàn)象和特點。方法選擇Sinofiler試劑盒檢測的案件8 261例，篩選該試劑盒15個STR基因座的突變事件，判斷突變等位基因的來源，統(tǒng)計各基因座的突變率，分析突變的特點。結(jié)果在15個基因座上發(fā)現(xiàn)175個突變事件，167例（95.43%）為一步突變，5例（2.86%）為二步突變，2例（1.14%）為三步突變，1例（0.57%）為五步突變。平均突變率為1.30×10-3（95%CI 1.12×10-3~1.51×10-3），各基因座的突變率介于0.45×10-3~2.56×10-3。父、母來源突變比例為13.33∶1。增加重復單位和減少重復單位的突變事件比值為1.10∶1。15個基因座的突變率與雜合度之間沒有統(tǒng)計學上的相關(guān)性。結(jié)論獲得的15個STR基因座突變資料在親子鑒定中有重要的應(yīng)用價值。

［關(guān)鍵詞］法醫(yī)物證學；短串聯(lián)重復序列（STR）；突變

短串聯(lián)重復序列（short tandem repeat，STR）具有高度多態(tài)性，被廣泛用于個體識別和親子鑒定。Sinofiler檢測試劑盒針對中國漢族人群的特點，將國際范圍廣泛應(yīng)用的Identifiler試劑盒中的TH01、TPOX基因座替換為D12S391、D6S1043基因座，對中國漢族人群的親權(quán)鑒定具有極高的使用價值［1］。D12S391和D6S1043比TH01、TPOX具有更高的多態(tài)性［2］。然而，高多態(tài)性常與高突變率并存。了解STR基因座的突變率和突變特點有利于親子鑒定實踐更準確、科學地進行結(jié)果評估。獲得常用STR基因座準確的突變率需要基于大樣本的研究數(shù)據(jù)。本文通過大樣本分析，對Sinofiler系統(tǒng)15個STR基因座的突變進行系統(tǒng)研究，報道如下。

1　材料和方法

1.1樣本材料

從南方醫(yī)科大學司法鑒定中心日常檢案中選擇Sinofiler試劑盒檢測并肯定親權(quán)的親子鑒定案件8 261例，其中三聯(lián)體709例，父子二聯(lián)體6 726例，母子二聯(lián)體826例。樣本包括人體血樣（17.4%）、唾液斑（74.1%）、帶毛囊毛發(fā)（5.8%）、羊水（1.9%）、精斑（0.6%）、組織（0.3%）。

1.2儀器與試劑

9700擴增儀（ABI，美國）；3130xL基因分析儀（ABI，美國）；AmpFLSTR?SinofilerTM試劑盒（ABI，美國）；STRtyper?10G試劑盒（珠?？频巧锟萍加邢薰荆?；AmpFLSTR?YfilerTM試劑盒（ABI，美國）；Investigator Argus X?12試劑盒（QIAGEN，德國）。

1.3DNA提取與STR檢測

采用chelex?100法提取DNA，擴增體系和熱循環(huán)反應(yīng)按試劑盒說明書進行，擴增產(chǎn)物在3130xl基因分析儀電泳，GeneMapper ID v3.2軟件進行基因分型。

1.4突變基因座、突變來源和突變步數(shù)的確定

用Sinofiler體系進行檢測，若違反遺傳規(guī)律基因座總數(shù)＜3，參照親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范［3］計算親權(quán)指數(shù)（paternity index，PI）、增加檢測STRtyper?10G系統(tǒng)，并增加X?STR或Y?STR檢測。若PI>10 000，且X?STR或Y?STR不違反遺傳規(guī)律，則認定親子關(guān)系，違反遺傳規(guī)律的基因座視為是突變基因座。

參照文獻［4］確定突變等位基因的來源：將孩子中的突變等位基因與發(fā)生突變的父方或母方等位基因相比較，相差步數(shù)最小的等位基因是突變的等位基因；若相差的步數(shù)相同，則判為來源不明。突變步數(shù)為重復單位的增加或減少，若同時存在增加或減少同步數(shù)的可能則判為不確定。短、中、長等位基因的確定參考文獻［5］。

1.5統(tǒng)計分析

用confint.xls軟件（http：//statpages.org/confint. html）計算突變率以及95%CI值。SPSS 13.0軟件進行Spearman相關(guān)性分析。

2　結(jié)果

2.1突變率和突變來源

在8 261例認定親子關(guān)系案例中，觀察8 970次減數(shù)分裂，共發(fā)現(xiàn)175個突變事件。15個STR基因座的突變率見表1，其中D12S391基因座的突變率最高，vWA次之，D2S1338和D19S433的突變率最低。175個突變事件中，父系突變的有160個（91.43%），母系突變的有12個（6.86%），其余3個（1.71%）不能確定突變來源。父系突變與母系突變的比例為13.33∶1。

表1　15個STR基因座的突變來源和突變率Table 1　Mutation resource and mutation rate of 15 STR loci

2.2突變類型、突變步數(shù)和突變方向

本研究所觀察到的175例突變家系中，均為單基因座突變。其中一步突變167例（95.43%），二步突變5例（2.86%），三步突變2例（1.14%）和五步突變1例（0.57%）。

65例表現(xiàn)為重復序列的增加，59例表現(xiàn)為重復序列的減少，另有51例不能確定增加或減少。重復序列增加與重復序列減少的比例為1.10∶1。

2.3突變與等位基因長度的關(guān)系

可確定突變中重復序列增減共124例。其中短、長等位基因突變例數(shù)分別為14例（11.3%）、31例（25%），而中等位基因突變例數(shù)為79例（63.7%），見表2。中等位基因中重復序列增加和減少的比例為1.08∶1；短等位基因中重復序列減少與重復序列增加的比例為3.67∶1；長等位基因中重復序列增加與重復序列減少的比例為2.88∶1。

表2　不同長度等位基因發(fā)生重復序列增加或減少的次數(shù)Table 2　Allele sizes versus number of repeat gain/loss

2.4雜合度與突變率的關(guān)系

15個STR基因座的雜合度與突變率情況見表3，多數(shù)基因座表現(xiàn)為雜合度高，突變率也高。但個別存在差異。如D6S1043基因座表現(xiàn)為最高的雜合度，但突變率僅為0.000 89。Spearman’s test顯示15個STR基因座的突變率與雜合度之間沒有顯著的相關(guān)性。

3　討論

本研究獲得的15個STR基因座的突變率介于0.45×10?3~2.56×10?3，其中D12S391基因座的突變率最高，其次為vWA、FGA和D18S51，D2S1338 和D19S433基因座的突變率最低。這可能與基因座內(nèi)重復序列的結(jié)構(gòu)有關(guān)［6?7］。親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范規(guī)定用于親權(quán)鑒定的遺傳標記的突變率應(yīng)低于0.002［3］。本研究所選取的案例中除了D12S391、vWA、FGA、D18S51基因座突變率大于0.002外，均符合此規(guī)律，因此采用這些STR基因座進行親權(quán)鑒定時應(yīng)注意其高突變率。

復制滑鏈錯配學說是目前普遍接受的突變機制［8］。在DNA復制過程中，新生鏈復制到模板鏈的STR序列區(qū)域時，由于序列是重復的，因此很容易發(fā)生堿基錯配，形成一個或數(shù)個重復序列的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。如果繼續(xù)復制下去，就會出現(xiàn)新生鏈比模板鏈加長或縮短的現(xiàn)象。即每個突變都是增加或減少一個或幾個重復單位。然而，對于STR突變模式有2種不同的觀點：一種是簡單突變模式，即等位基因的突變，無論是延長或收縮多少個重復單位都是一步完成。另一種是逐步突變模式，即突變是經(jīng)過多步才能完成，每一步只是增加或減少一個重復單位，每一步都有一定的發(fā)生率，步數(shù)越多的，發(fā)生的機會就越少，這種觀點為多數(shù)學者認可。本研究符合逐步突變模式，觀察到一步突變167例，占總數(shù)的95.43%。此外，研究結(jié)果還顯示重復單位增加和減少的比例約為1.1∶1。這表明在STR基因突變中重復序列的增加和重復序列的減少是有差異的，增加比減少更為常見，這與陳玲［5］、李茜等［9］研究結(jié)果相符合。本研究觀察到罕見的三步突變2例、五步突變1例，且排除是引物結(jié)合點變異導致的等位基因丟失，確認為突變。目前有文獻報道過三步突變［10-11］、四步突變［12-13］?？傮w來看，多步突變發(fā)生的機率很低，判斷多步突變需慎重。

本研究顯示來自父系和母系來源的突變比例為13.33∶1，具有明顯性別差異。突變與干細胞發(fā)生過程中細胞所經(jīng)過的分裂次數(shù)有關(guān)。男性精母細胞分裂成精子需要的分裂次數(shù)比女性配子細胞成熟需要的次數(shù)要多得多，因此突變發(fā)生在男性的概率更大。與其他研究相比，劉素娟等［14］觀察10 000個三聯(lián)體親子鑒定，發(fā)現(xiàn)PowerPlexTM16系統(tǒng)15個STR基因座的父、母源突變比值為3.57∶1。Qian［15］發(fā)現(xiàn)15個STR基因座的父、母源突變比例為5.2∶1，其觀察的減數(shù)分裂次數(shù)男女比例為2.6∶1。帥莉等［16］報道父系和母系來源的突變比例為10∶1，但未指明父源、母源的等位基因傳遞次數(shù)。上述研究與本研究數(shù)據(jù)存在較大差異。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的結(jié)果可能與不同研究的群體結(jié)構(gòu)、樣本數(shù)量有關(guān)。本研究樣本人群主要以二聯(lián)體為主，二聯(lián)體中又以父子二聯(lián)體為主，父源、母源等位基因傳遞次數(shù)的比值為4.84∶1，因此表現(xiàn)為父源突變比例偏高。

突變與等位基因長度關(guān)系的研究結(jié)果顯示突變主要發(fā)生在中等位基因，且重復序列增加和重復序列減少的例數(shù)接近。長等位基因（重復次數(shù)多的等位基因）發(fā)生的突變案例中大部分表現(xiàn)為重復單位的減少，可見長等位基因基因的突變傾向于縮短。短等位基因（重復次數(shù)少的等位基因）發(fā)生突變的概率最低，14例中有11例表現(xiàn)為重復單位的增加，提示短等位基因的突變傾向于延長。這表明STR等位基因的突變存在自控性，防止等位基因的無限變大或無限變小，從而支持等位基因的種類穩(wěn)定，這與Lu等［17］的研究結(jié)果一致。

參照文獻［18］獲得本研究人群15個STR基因座的雜合度數(shù)據(jù)，并研究雜合度和突變率之間的相關(guān)性，結(jié)果表明雜合度與突變率之間無統(tǒng)計學上的相關(guān)性，這與Leopoldino［19］的研究結(jié)果一致。由于不同群體結(jié)構(gòu)、樣本數(shù)量和每個STR基因座的結(jié)構(gòu)特征存在差異，表現(xiàn)為雜合度、突變率各不相同。因此，進行親子鑒定時，應(yīng)注意此現(xiàn)象的存在，盡量選取多態(tài)性高、突變率低的基因座進行鑒定。

STR突變是法醫(yī)物證鑒定中經(jīng)常遇到的情形，而且是一個不可忽視的風險因素。為降低誤判風險，建議做好以下幾方面：（1）詢問案情，如了解爭議父或爭議母與孩子之間是否有親緣關(guān)系（如爺孫、姑侄關(guān)系等），若二者有親緣關(guān)系，那爭取兩位可疑的父親或母親都參與鑒定。（2）若單親出現(xiàn)突變，盡量追加父方或母方樣品檢測。（3）根據(jù)情況增加性染色體STR、SNP和（或）INDEL、線粒體DNA等其他遺傳標記，必要時可應(yīng)用二代測序技術(shù)輔助鑒定。

表3　雜合度與突變率的關(guān)系Table 3　The relation of heterozygosity and mutation rate for 15 STR loci

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2.廣州市刑事科學技術(shù)研究所，廣東，廣州510030

★通訊作者：陳玲，E?mail：lingpzy@163.com

基金項目：廣東省醫(yī)學科學技術(shù)研究基金（A2015043）

作者單位：1.南方醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院法醫(yī)學系，廣東，廣州510515

Mutations of 15 Short Tandem Repeat Loci for forensic application

QIU Pingming1,CHEN Ling1★,YU Jiaxin1,LU Huijie1,NIU Mufei1,LIU Chao1,2
(1.Department of Forensic Medicine,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong,China,510515; 2.Guangzhou Forensic Science Institute,Guangzhou,Guangdong,China,510030)

［ABSTRACT］ObjectiveTo analyze the characteristics of 15 STR loci mutations and their roles in paternity tests.Methods8 261 confirmed parentage cases detected by Sinofiler System were analyzed.The mutation events in 15 STR loci of Sinofiler System were screened,and the sources of mutant alleles were analyzed.Finally,the mutation rates of STR loci were calculated and the features of these mutations were examined.Results175 mutation events were observed in 15 STR loci.Among them,167(95.43%)were one?step,5(2.86%)were two?step,one(1.14%)was three?step and one(0.57%)was five?step.The overall mutation rate was 1.30×10-3（95%CI 1.12×10-3~1.51×10-3）,and the locus?specific mutation rates ranged from 0.45×10-3~2.56×10-3.The ratio of paternal versus maternal mutation was 13.33:1．The ratio of repeat gains versus repeat losses was 1.10:1.No statistical correlation between mutation rate and heterozygosity at 15 STR loci was detected.ConclusionMutations in the 15 STR loci can play a valuable role in paternity tests.

［KEY WORDS］Forensic biological evidence;Short tandem repeat(STR);Mutation