糖尿病大鼠血管平滑肌細胞體外培養及Notch信號通路對其細胞增殖及凋亡的研究①

汪寶林，金　松 ，范東旭 ，馮東凡， 謝　涵

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

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糖尿病大鼠血管平滑肌細胞體外培養及Notch信號通路對其細胞增殖及凋亡的研究①

汪寶林，金松 ，范東旭 ，馮東凡， 謝涵

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：應用γ-分泌酶抑制劑(DAPT)對Notch信號通路進行干預后采用流式細胞學技術檢測并探討DM大鼠VSMCs細胞增值及凋亡機制。方法：應用腹腔內注射鏈脲佐菌素的方法對大鼠進行糖尿病造模。造模后別于CON組和DM組(1、2、3、4)各組中隨機取出1只SD大鼠，取出主動脈并制備成細胞懸液，在細胞培養箱培養一段時間后進行傳代，應用不同梯度濃度γ-分泌酶抑制劑(DAPT)對Notch信號通路進行干預，流式細胞技術檢測DM大鼠VSMCs細胞增值及凋亡情況。結果：不同梯度濃度的DAPT作用DM大鼠VSMCs72h后行流式細胞儀分析，G0/G1期細胞比例由39.97%上升為72.32%，S 期的細胞比例從41.10%下降為19.87%，凋亡數卻從3.1升高至15.4(P<0.05)。結論：DAPT能影響DM大鼠VSMCs的細胞周期，減少DM大鼠VSMCs的有絲分裂，抑制細胞增殖反向增加細胞凋亡數，這二者作用均具有依賴性且呈正相關。

關鍵詞：Notch信號通路；血管平滑肌細胞；體外培養；流式細胞學技術；細胞增殖；細胞凋亡

目前，對于糖尿病足的治療大多處于內科治療聯合局部清創治療為主，截趾、截跖、截肢是最終結果[1]。介入治療和血管重建需要的設備精密價格昂貴，手術費用高，并發癥多，術后再狹窄率高[2]。相關實驗性研究表明，Notch信號通路能促進非糖尿病動物缺血區的血管新生、動靜脈分化等[3]。本課題研究DM大鼠主動脈VSMCs體外培養及Notch信號通路受干預后對其影響的情況，以及可能的信號轉導機制，為進一步研究DM缺血區血管新生提供實驗理論依據。

1實驗對象

SPF(Specific Pathogen Free，無特定病原體)級SD大鼠雄性3只、雌性6只，2月齡，體重：雄性：(191±2.5)g，雌性：(207±1.9)g，購自大連醫科大學動物實驗中心，質量合格證0003546。

2實驗方法

2.1大鼠造模

糖尿病大鼠模型建立：雄性SD大鼠幼鼠50只，隨機抽取10只為正常對照組(CON組)，其余40只為糖尿病組(DM組)。CON組一次性腹腔注射0.1mL/100g無菌檸檬酸緩沖液(0.1mmol/L, pH4.4)；DM組按45mg/kg一次性腹腔內注射鏈脲佐菌素(STZ)。每日觀察幼鼠情況并給予脂肪乳高糖混合液喂養。分別于造模后7d、14d、21d檢測各幼鼠血糖變化情況，3次測量血糖值均≥16.7mmol/L列為糖尿病模型。

2.2糖尿病SD大鼠主動脈血管平滑肌細胞原代培養[4]

①8周齡時，分別于CON組和DM組各組中隨機取出一只SD大鼠，鈍性分離暴露心臟至主動脈段血管，取出主動脈，迅速移至無菌D-Hank’s液的培養皿中。②在體式解剖顯微鏡下，剝脫血管外膜，縱向剪開血管壁，刮除內膜后剩余血管中膜，除去殘留中膜外組織雜質。③放入胎牛血清的DMEM培養液中并將其剪碎，離心5min，棄上清，取沉淀，往沉淀物中加入0.5% EDTA ·4Na消化30 s。④加入等體積DMEM 培養基終止消化并1500 r/min(r=13.5cm)離心5min，棄上清液，離心管中加入2 mL 新鮮培養基重懸。⑤用吸管將其移入細胞培養瓶貼附于底面，輕輕將培養瓶翻轉，培養箱內孵育2～3 h后，組織塊貼壁后將培養瓶翻轉，加入適量含20%胎牛血清的DMEM 培養液，使組織塊完全浸沒于培養液之中，繼續靜置培養。⑥培養至8～12d時倒置相差顯微鏡下觀察見80%細胞已融合，即可進行細胞傳代及檢測。

2.3流式細胞術檢測

2.3.1細胞周期及增值測定

①取對數期的DM大鼠VSMCs，常規消化制成單細胞懸液，以2.0×105/mL密度接種于6孔培養板中，培養24h。②加入工作液濃度為0.15、1.25、2.50、7.50、10.00μmol/Lγ-分泌酶抑制劑DAPT，Control組不加，繼續培養72h。③收集所有細胞，簡單細胞計數，將約1×106個細胞移入離心管中，1000r/min(r=13.5cm)離心5min，棄去上清后。用PBS溶液清洗×1次，在離心管中留約0.5mL PBS，加70%冰乙醇5mL混勻固定，4℃放置48h以上，離心棄上清。PBS清洗×1次，在離心管中留1mL PBS，輕輕吹打均勻細胞，加入10mg/mL的RNAse5μL，37℃放置1h。加入100μg/mL的PI工作液10μL，室溫避光染色30min，計數20000～30000個細胞，流式細胞儀檢測細胞周期時相。細胞DNA合成期和分裂期,既G2+M期是細胞增殖的兩個重要指標,兩者之合稱為增殖指數,而增殖指數的大小則反映細胞增殖水平的高低。

2.3.2細胞凋亡測定

步驟與周期測定一致，在乙醇固定后上機檢測：①上機檢測前離心去除乙醇。②冷I,Bs(pH7.4)洗5min后離心,重復2次,調整細胞數為106個/L。③加入pl工作液0.5mL,終濃度為10m叭,室溫避光30min后上機流式細胞儀檢測。

2.4統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件。以P<0.05有顯著性差異。

3結果

3.1細胞周期結果

各組72h后行流式細胞儀分析，G0/G1期細胞比例由Control組的39.97%上升為72.32%，S期的細胞比例從Control組的41.10%下降為19.87%見表1，差異有顯著統計學意義(P<0.05)。

表1　各組細胞周期結果(%)

3.2細胞增殖與凋亡

細胞DNA合成期和分裂期,既G2+M期是細胞增殖的兩個重要指標,兩者之合稱為增殖指數,而增殖指數的大小則反映細胞增殖水平的高低。各組經不同濃度γ-分泌酶抑制劑DAPT干預后，其增值與凋亡見表2。Control組的細胞增殖指數從35.65降到15.42(P<0.05)，凋亡數卻從3.1升高至15.4(P<0.05)。

表2　各組細胞增值與凋亡結果

4討論

糖尿病足的發病率國外報道為5.3%～10.5%，我國國內報道是8.57%，2-DM患者的截肢率比非DM患者高17～40倍[5]，且正逐年增加，不但嚴重威脅DM患者的健康和生活質量，而且也造成了巨大的醫療、社會、經濟問題。近年來已引起國內外醫生對DF的關注與重視，并積極研究其治療方法。

相關實驗性研究表明，Notch信號通路能促進非糖尿病動物缺血區的血管新生、動靜脈分化等[3]。本實驗對DM大鼠模型凍存細胞復蘇開始，采用不同梯度濃度的DAPT進行干預，應用流式細胞技術檢測DM大鼠VSMCs細胞周期情況并計算出其增殖指數及細胞凋亡數分析探討Notch信號途徑對體外培養的DM大鼠VSMCs的影響，為進一步研究糖尿病患者缺血區血管增值提供實驗依據，為糖尿病足及糖尿病血管病變的治療提供新的思路。

γ-分泌酶在Notch信號通路激活的連鎖反應中其重要作用，γ-分泌酶抑制劑(DAPT)可有效阻斷Notch信號通路中NICD的產生。 DAPT是人工合成的Notch信號通路抑制劑，可特異性抑制γ-分泌酶活性，進而抑制Notch受體的在S3位點的酶切，而有效的抑制Notch信號通路的激活，從而抑制細胞生長[6，7]。

本實驗結果顯示不同梯度濃度的DAPT作用DM大鼠VSMCs72h后行流式細胞儀分析，G0/G1期細胞比例由Control組的39.97%上升為72.32%，S 期的細胞比例從Control組的41.10%下降為19.87%，結果證明與Control組相比DAPT明顯抑制DM大鼠VSMCs進入S期和G2/M期，且有濃度依賴性，，差異有統計學意義(P<0.05)，細胞DNA合成期和分裂期,既G2+M期是細胞增殖的兩個重要指標,兩者之合稱為增殖指數,而增殖指數的大小則反映細胞增殖水平的高低[8]。各組經不同濃度γ-分泌酶抑制劑DAPT干預后，Control組的細胞增殖指數從35.65降到15.42(P<0.05)，凋亡數卻從3.1升高至15.4(P<0.05)。證明DAPT能影響DM大鼠VSMCs的細胞周期，減少DM大鼠VSMCs的有絲分裂，抑制細胞增殖，反向增加細胞凋亡數，這二者作用均具有依賴性且呈正相關。這闡明了Notch信號通路潛在的藥物治療靶點，可能成為DF、DM血管病變及缺血性疾病的治療提供新的手段和新方向。

參考文獻:

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[8]姜成,李春豐,呂東云,等. 多媒體技術在細胞生物學教學中的應用[J]. 黑龍江醫藥科學,2011,34(3):63

作者簡介：①汪寶林(1988～)男，黑龍江大興安嶺人，碩士，醫師。 通訊作者：范東旭(1971～)男,黑龍江佳木斯人，碩士，副主任醫師，教授，碩士研究生導師。E-mail: 809824056@qq.com。

中圖分類號：R587.1

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)04-0105-02

(收稿日期：2015-05-04)