基因工程實(shí)驗(yàn)課教學(xué)改革的再探索

王昕+韓俊艷+王劍峰+楊彩霞

摘要：本文對(duì)近年來基因工程實(shí)驗(yàn)課教改進(jìn)行再探索，設(shè)計(jì)兩種蛋白質(zhì)的原核表達(dá)純化及活性測定實(shí)驗(yàn)，學(xué)生從中任選一種，完成各自實(shí)驗(yàn)后合作完成最終實(shí)驗(yàn)。此改革拓寬了學(xué)生的學(xué)術(shù)視野，鍛煉了學(xué)生的自學(xué)能力和團(tuán)隊(duì)合作能力。

關(guān)鍵詞：基因工程實(shí)驗(yàn)課；教學(xué)改革；原核表達(dá)純化；活性測定

中圖分類號(hào)：G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2017）08-0265-02

誕生于20世紀(jì)70年代初的DNA重組技術(shù)是一種獲取、整理、破譯、編輯和表達(dá)生物遺傳信息的現(xiàn)代生物技術(shù)，它在諸多方面日益顯示出極高的實(shí)用價(jià)值。目前，作為DNA重組技術(shù)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的基因工程，正在驅(qū)動(dòng)著人類社會(huì)生活方式的重大變革。在這一技術(shù)浪潮的推動(dòng)下，基因工程已成為生物科學(xué)、生物工程和生物技術(shù)本科生的專業(yè)主干課程之一。與其他生物學(xué)專業(yè)課相比基因工程稍有不同，其他生物學(xué)專業(yè)課比較注重理論部分而對(duì)實(shí)驗(yàn)部分要求不高（如植物生理學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等），但基因工程卻理論與實(shí)驗(yàn)并重，因此實(shí)驗(yàn)課在本門課程中的地位就更加重要。通過實(shí)驗(yàn)課的鍛煉，我們不但能幫助學(xué)生提高動(dòng)手能力，還能反過來加深對(duì)理論課的理解，這有助于加強(qiáng)學(xué)生的實(shí)踐能力和創(chuàng)新精神。作為一門炙手可熱的前沿科學(xué)，近年來基因工程的最新進(jìn)展可謂日新月異眼花繚亂，在此大背景下基因工程本科教學(xué)就必須與時(shí)俱進(jìn)，不斷革新從而跟上時(shí)代發(fā)展的腳步。本文在近年來基因工程實(shí)驗(yàn)課改革的基礎(chǔ)上再次創(chuàng)新，設(shè)計(jì)了兩種蛋白質(zhì)的原核表達(dá)純化及活性測定實(shí)驗(yàn)，通過創(chuàng)新的實(shí)驗(yàn)安排使學(xué)生在相同的課時(shí)中收獲更多的知識(shí)，得到更多的鍛煉。

Lon蛋白酶廣泛地分布于微生物、動(dòng)植物和人類中，是一種多結(jié)構(gòu)域的、ATP依賴型的蛋白酶，負(fù)責(zé)降解細(xì)胞內(nèi)特殊的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、有缺陷的蛋白質(zhì)和異常蛋白質(zhì)，與此同時(shí)Lon蛋白酶還具有分子伴侶活性。Lon蛋白酶的這種多活性特點(diǎn)為我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了較大的空間。綠色熒光蛋白（green fluorescent protein GFP）在藍(lán)色波長范圍的光線激發(fā)下會(huì)發(fā)出綠色螢光，因此在日常白光照射下GFP即可呈現(xiàn)出綠色。GFP在低PH值條件下變性后會(huì)喪失綠色熒光，經(jīng)Lon蛋白酶分子伴侶活性作用后復(fù)性又能夠恢復(fù)綠色熒光。GFP蛋白的這種可見特性為初學(xué)者的實(shí)驗(yàn)操作增加了趣味性。本文設(shè)計(jì)了這兩種蛋白質(zhì)的原核表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)它們的特性設(shè)計(jì)了后續(xù)的活性測定實(shí)驗(yàn)。

一、進(jìn)一步探索教學(xué)改革的目的

當(dāng)前的大多數(shù)基因工程實(shí)驗(yàn)課教學(xué)改革是設(shè)計(jì)了一個(gè)蛋白質(zhì)的原核表達(dá)及純化實(shí)驗(yàn)。這樣的設(shè)計(jì)不僅較為完整地覆蓋了基因工程的實(shí)驗(yàn)步驟，而且還將原有的分散的支離破碎的實(shí)驗(yàn)安排整合為一個(gè)有機(jī)的整體。整個(gè)實(shí)驗(yàn)可將載體的酶切、連接、載體構(gòu)建、原核宿主轉(zhuǎn)化、重組子的鑒定、蛋白質(zhì)的表達(dá)純化等相關(guān)實(shí)驗(yàn)有機(jī)地整合起來，是一個(gè)前后相繼緊密銜接的整體。學(xué)生在每個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中都必須小心謹(jǐn)慎全身心投入，因?yàn)槊恳粋€(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果都是后一個(gè)實(shí)驗(yàn)的初始材料，這就好比一個(gè)串聯(lián)電路，一點(diǎn)斷開全盤皆輸。這就要求同學(xué)們必須極其專心，直到全部實(shí)驗(yàn)完成，從而使學(xué)生產(chǎn)生更加深刻的印象，從而顯著地提升了教學(xué)質(zhì)量。但是經(jīng)過一段時(shí)間的教學(xué)實(shí)踐后，我們又發(fā)現(xiàn)了一些有待改進(jìn)的地方。（1）已有的實(shí)驗(yàn)改革雖已覆蓋基因工程“切、接、轉(zhuǎn)、增、檢”的基本實(shí)驗(yàn)步驟，但尚未明確涉及目的蛋白的活性檢測實(shí)驗(yàn)，因此依然存在實(shí)驗(yàn)覆蓋面不夠完整的問題。（2）因?yàn)橐延械膶?shí)驗(yàn)改革只設(shè)計(jì)了一個(gè)蛋白質(zhì)的原核表達(dá)純化，所以無法比較不同蛋白質(zhì)表達(dá)純化過程中存在的不同問題。這樣便限制了學(xué)生的學(xué)術(shù)視野，很可能會(huì)誤認(rèn)為不同蛋白質(zhì)的原核表達(dá)及純化實(shí)驗(yàn)鮮有區(qū)別。（3）實(shí)驗(yàn)中的目的蛋白基本不可見，使初學(xué)者感到實(shí)驗(yàn)操作單調(diào)乏味，進(jìn)而影響了學(xué)習(xí)興趣。本文針對(duì)這些問題進(jìn)行了教學(xué)改革，從而進(jìn)一步提高了教學(xué)質(zhì)量。

二、教學(xué)改革內(nèi)容

本實(shí)驗(yàn)改革設(shè)計(jì)了Lon蛋白酶和GFP兩種蛋白質(zhì)的原核表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)，學(xué)生經(jīng)分組后可任意選取一種蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)純化，然后各自進(jìn)行Lon蛋白酶的蛋白酶活性測定實(shí)驗(yàn)和GFP變性實(shí)驗(yàn)。完成各自全部實(shí)驗(yàn)后，表達(dá)純化不同蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)小組使用各自產(chǎn)物，以合作的方式完成以GFP為底物測定Lon蛋白酶分子伴侶活性的實(shí)驗(yàn)。

具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下：（1）使用限制性核酸內(nèi)切酶雙酶切中間載體上的目的基因片段和表達(dá)載體，然后進(jìn)行膠回收；（2）使用T4 DNA連接酶將目的基因片段連接到表達(dá)載體上；（3）感受態(tài)制備和轉(zhuǎn)化；（4）重組子篩選；（5）重組蛋白的表達(dá)和純化；（6）測定Lon蛋白酶的蛋白酶活性或進(jìn)行GFP蛋白失活實(shí)驗(yàn)；（7）以GFP蛋白為底物測定Lon蛋白酶的分子伴侶活性；

（8）討論各自實(shí)驗(yàn)過程中的心得體會(huì)；（9）撰寫實(shí)驗(yàn)論文。在第8部分討論環(huán)節(jié)中，要求學(xué)生充分交流不同蛋白質(zhì)表達(dá)純化過程中遇到的問題以及解決方式。然后在撰寫實(shí)驗(yàn)論文中將兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)過程進(jìn)行比較，分析每種蛋白質(zhì)表達(dá)純化過程中的難點(diǎn)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)出自本人的科研課題，因此整個(gè)流程非常成熟可靠性很高，便于初學(xué)者掌握基因工程實(shí)驗(yàn)的基本知識(shí)和流程。

三、教學(xué)改革總結(jié)

本文設(shè)計(jì)了兩種蛋白質(zhì)的原核表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)，兩者雖然技術(shù)路線相同，但是又有各自特有的有待解決的技術(shù)問題。通過教師的介紹和引導(dǎo)，每個(gè)學(xué)生實(shí)驗(yàn)小組自主選擇實(shí)驗(yàn)課題，完成各自實(shí)驗(yàn)后再使用各自產(chǎn)物合作完成最終實(shí)驗(yàn)。

總體來說本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)解決了以下幾點(diǎn)教學(xué)問題：（1）通過取消重復(fù)實(shí)驗(yàn)拓寬了實(shí)驗(yàn)課覆蓋面：我們將與分子生物學(xué)重復(fù)的實(shí)驗(yàn)（目的基因獲取相關(guān)實(shí)驗(yàn)，即總DNA提取和PCR等實(shí)驗(yàn)）取消，直接向?qū)W生提供目的基因片段。這樣既避免了實(shí)驗(yàn)重復(fù)，又為新增的目的蛋白活性檢測實(shí)驗(yàn)節(jié)省了必要的課時(shí)。（2）通過二選一的方式為實(shí)驗(yàn)課擴(kuò)容：如果要求學(xué)生同時(shí)表達(dá)純化兩種蛋白質(zhì)，則工作量過大難以實(shí)現(xiàn)。所以我們要求學(xué)生自主決定任選其一，然后相互交流討論各自實(shí)驗(yàn)過程中的心得體會(huì)。這種選擇性設(shè)計(jì)會(huì)促使學(xué)生主動(dòng)思考問題，同時(shí)也無形中擴(kuò)大了實(shí)驗(yàn)課容量拓寬了學(xué)生的學(xué)術(shù)視野，討論環(huán)節(jié)的設(shè)置還會(huì)鍛煉學(xué)生的學(xué)術(shù)交流能力。（3）增加實(shí)驗(yàn)趣味性：GFP是一種肉眼可見的蛋白質(zhì)，在其表達(dá)純化過程中會(huì)伴有綠色出現(xiàn)。Lon蛋白酶雖肉眼不可見，但在其活性測定過程中依然會(huì)出現(xiàn)肉眼可見的底物顏色變化。這樣便使基因工程實(shí)驗(yàn)初學(xué)者的操作變得有趣起來，從而激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。（4）培養(yǎng)學(xué)生的團(tuán)隊(duì)合作能力：表達(dá)純化不同蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)小組，最終要拿著各自的產(chǎn)物共同完成最終的實(shí)驗(yàn)。這樣的設(shè)計(jì)使學(xué)生認(rèn)識(shí)到團(tuán)隊(duì)合作的重要性，因?yàn)闆]有其他小組純化的蛋白質(zhì)任何小組都無法獨(dú)立完成所有實(shí)驗(yàn)。

這種新穎的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)充分調(diào)動(dòng)了學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性，鍛煉了學(xué)生的獨(dú)立思考能力和團(tuán)隊(duì)合作能力，使學(xué)生由傳統(tǒng)教學(xué)中的被動(dòng)接受者變成了主動(dòng)的探索者、積極的討論者和負(fù)責(zé)的合作者。通過教學(xué)實(shí)踐，我們發(fā)現(xiàn)此教學(xué)設(shè)計(jì)取得了良好的教學(xué)效果，獲得了學(xué)生的支持和好評(píng)。

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