鬼臼毒素二元醇質體體外抗宮頸HPV感染的研究

種樹彬+王小婕+陳如大+曾抗+李慶賢+葉艷芬

【摘要】 目的 研究鬼臼毒素二元醇質體（POD-BE）體外抗宮頸人乳頭瘤病毒（HPV）感染的效果。方法 采用超聲注入法制備POD-BE， 采用透析法測定POD-BE包封率（EE%） ， 觀察POD-BE形態學、外觀性狀及穩定性， 運用CCK-8法和流式細胞術（FCM）分別檢測POD-BE和POD處理后永生化人宮頸上皮細胞（H8細胞）的增殖和凋亡， 以透射電鏡和激光共聚焦顯微鏡 （LCSM）分別觀察細胞的形態變化及藥物在細胞的分布。結果 制備的POD-BE混懸液電鏡下為類球狀小囊泡， 平均粒徑（84.6±9.2）nm， Zeta電位（-27.2±4.2）mV。保存在4℃冰箱內的POD-BE樣本， 6個月內仍保持半透明、質地均勻外觀， 未見沉淀及藥物結晶析出。3000 r/min離心20 min未發現分層現象。而保存在室溫下的樣本， 24 h未見任何變化， 3～6個月時出現少許混濁， 震蕩后樣本恢復均一外觀， 未見藥物結晶析出。POD-BE組和POD組均呈劑量和時間依賴性地抑制H8細胞的增殖。在相同濃度同一時間條件下， POD-BE組對H8細胞的增殖抑制效果明顯強于POD組（P<0.01）。POD-BE組 12、24、48 h的半數抑制濃度（IC50）分別為782、595、97 μg/L， 而POD組的IC50則分別為1966、1570、758 μg/L；空白BE組對細胞無明顯毒性。與空白對照組相比， POD-BE組和POD組均能明顯誘導H8細胞凋亡（P<0.01）；然而POD-BE組誘導凋亡的效果則顯著強于POD組（P<0.01）。10 μg/L的POD-BE和POD分別處理H8細胞24 h后， 透射電鏡下顯示： H8細胞被藥物處理后其染色質高度凝聚、邊緣化， 形成凋亡小體。H8細胞分別被POD-BE和POD處理24 h后， 兩組的熒光均表現出聚集于細胞核的趨勢， 且POD-BE組較POD組熒光信號強度顯著增強， 而空白BE組和空白對照組未見有陽性熒光信號表達。結論 POD-BE具備理想的理化性質， POD-BE較POD對H8細胞具有更強的增殖抑制和凋亡誘導效果。

【關鍵詞】 鬼臼毒素；二元醇質體； 細胞凋亡； 宮頸人乳頭瘤病毒

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.01.001

Research of podophyllotoxin binary ethosomes in external anti-cervical HPV infection ZHONG Shu-bin， WANG Xiao-jie， CHEN Ru-da， et al. Department of Dermatology， Nanhai Affiliated Hospital of Southern Medical University， Guangzhou 510515， China

【Abstract】 Objective To research effect by podophyllotoxin binary ethosomes （POD-BE） in external anti-cervical human papilloma virus （HPV） infection. Methods POD-BE was prepared by ultrasonic injection method， and encapsulation efficiency （EE%） of POD-BE was detected by dialysis method. Observation was made on morphology， external properties and stability of POD-BE. CCK-8 method and flow cytometry method （FCM） were applied to detect POD-BE and multiplication and apoptosis of immortalized human cervical epithelial cell （H8 cell） after POD treatment. Transmission electron microscope and laser scanning confocal microscope （LCSM） were applied to respectively observe morphologic change and drug distribution of cell. Results Prepared POD-BE suspension showed globular small vesicae under electron microscope， with mean grain diameter as （84.6±9.2） mm and Zeta electric potential as （-27.2±4.2） mV. POD-BE samples in 4℃ refrigerator showed semitransparent and balanced appearance without sediment and drug crystal separation. No stratification appeared after 20 min of centrifugation by 3000 r/min. Samples in indoor temperature showed no changes after 24 h， while there was a few suspension in 3～6 months without drug crystal separation after shock. Both POD-BE group and POD group showed H8 cell proliferation inhibition with dosage and time dependence. Under the condition of same concentration， POD-BE group showed stronger proliferation inhibition effect on H8 cell than POD group （P<0.01）. POD-BE group had median inhibitory concentration （IC50） in 12， 24 and 48 h respectively as 782， 595 and 97 μg/L， which were respectively 1966， 1570 and 758 μg/L in POD group. Blank BE group showed no obvious cytotoxicity. Comparing with blank control group， POD-BE group and POD group showed obvious induction on H8 apoptosis （P<0.01）， and POD-BE group had stronger apoptosis induction effect than POD group （P<0.01）. After H8 treated by POD-BE and POD respectively by 10 μg/L for 24 h， transmission electron microscope showed high chromatin condensation， marginalization and formed apoptotic body in H8 cell. After 24 h treatment by POD-BE and POD in H8 cell， both groups showed fluorescence focused on cell nucleus， and POD-BE group had obviously stronger fluorescence signal than POD group， while there was no positive fluorescence signal expression in blank BE group and blank control group. Conclusion Due to its ideal physicochemical property， POD-BE provides more stronger proliferation inhibition and apoptosis induction effects on H8 cell than POD.

【Key words】 Podophyllotoxin； Binary ethosomes； Apoptosis； Cervical human papilloma virus

尖銳濕疣（condyloma acuminatum， CA）是由人乳頭瘤病毒（human papilloma virus， HPV）感染引起的性傳播疾病， 而高危型HPV是導致女性宮頸癌的主要原因[1]。鬼臼毒素（podophyllotoxin， POD）酊劑是治療CA最有效的一線藥物， 在臨床上應用廣泛。但其靶向性和黏附性差， 對皮膚及黏膜的刺激性大， 不適宜用于陰道和宮頸CA的治療， 且對HPV潛伏感染療效不佳， 因而其臨床應用和療效發揮受到了限制。隨著納米醫藥學的發展， “醇質體”（ethosomes， E）作為一種新型的藥物載體， 以其良好的組織相容性和靶向緩釋特性， 正日益成為局部藥物治療的研究熱點[2]。在“醇質體”處方中， 引入丙二醇， 則變成“二元醇質體”（binary ethosomes， BE）。本課題組在既往研究及相關研究的基礎上[3， 4]， 利用納米技術制備了靶向性更強的POD-BE， 以H8細胞（HPV16陽性）為靶細胞， 通過研究其對細胞增殖和凋亡的影響， 為宮頸HPV的臨床防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1. 1 POD-BE的制備和包封率（EE%）測定 采用超聲注入法制備POD-BE。取處方量鬼臼毒素、卵磷脂、膽固醇用無水乙醇/丙二醇混合溶劑溶解， 在密閉條件下邊攪拌邊用注射器加入超純水， 磁力攪拌1000 r/min， 將注射器中的超純水以180 μl/min的流速注入磷脂混懸液中， 注入完后再攪拌30 min， 溫度始終維持在30℃。然后在冰水浴條件下超聲處理1 min， 再經過過濾即得POD-BE。POD-BE包封率（EE%） 測定采用透析法測定[4]。

1. 2 POD-BE形態學、外觀性狀及穩定性觀察 將稀釋至一定濃度的POD-BE滴加在覆蓋碳膜的銅網上， 以 3%磷鎢酸負染， 使用透射電鏡觀察其粒徑大小和形態， 并照相。然后分別將樣品置于4℃及室溫下儲藏， 在 24 h 及6 個月時檢測其粒徑及包封率， 并3000 r/min離心20 min， 觀察是否分層或出現沉淀。

1. 3 H8細胞培養和POD-BE的增殖抑制效應 將H8細胞株（中國醫學科學院基礎醫學研究所提供）在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中進行常規傳代培養。取濃度為2.5×105/ml的對數生長期的H8細胞接種于96孔板中， 每孔200 μl。實驗分為POD-BE組、POD組、空白BE組（加入等體積的空白BE混懸液）、空白對照組（加入等體積的培養液）， 其中POD-BE組、POD組分別設0.1、1、10、100、1000 μg/L濃度組。每孔均設3個復孔。分別培養12、24、48 h后， 加入10 μl濃度為5 mg/ml的CCK-8溶液， 以酶標儀檢測各孔OD值（λ=450 nm）。細胞增殖抑制率= [（對照-本底）-（給藥-本底）]/ （對照-本底）×100%。Logit 法計算半數抑制濃度。

1. 4 Annexin V/PI檢測細胞凋亡 調整細胞濃度為1×106/ml， 實驗分為POD-BE組、POD組和空白對照組（加入等體積的培養液）， 其中POD-BE組、POD組分別加入含終濃度均為10 μg/L POD和POD-BE培養液， 藥物干預24 h后， 收集細胞， 按Annexin V/PI試劑盒說明進行檢測。

1. 5 電鏡觀察H8細胞的凋亡形態 取細胞濃度為1×106/ml的H8細胞接種于直徑3.5 cm的培養皿中， 分別加入終濃度均為10 μg/L培養皿的POD-BE和POD， 對照組加入等體積的培養液， 培養24 h后， 用透射電鏡觀察細胞超微結構， 見參考文獻[5]。

1. 6 LCSM觀察藥物在細胞的分布 取對數生長期的H8細胞， 接種于內置有蓋玻片的共聚焦顯微鏡專用培養皿內， 實驗分為POD-BE組（加入終濃度為10 μg/L POD-BE培養液）、POD組（加入終濃度為10 μg/L POD培養液）、空白BE組（加入等體積的空白BE混懸液）和空白對照組（加入等體積的培養液）， 藥物作用24 h后， LCSM觀察其在細胞的俘獲分布。

1. 7 統計學方法 采用SPSS21.0統計學軟件對所得數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 各組間比較采用單因素方差分析， 多重比較采用LSD法。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 POD-BE的形態、粒徑、電位及包封率 制備的POD-BE

混懸液電鏡下為類球狀小囊泡， 形態圓整， 粒徑小而均勻， 平均粒徑（84.6±9.2）nm（見圖1）， Zeta電位（-27.2±4.2）mV。3份樣本中POD的平均包封率為（86.3±2.3）%。

2. 2 穩定性實驗 保存在4℃冰箱內的POD-BE樣本， 6個月內仍保持半透明、質地均勻外觀， 未見沉淀及藥物結晶析出。3000 r/min離心20 min未發現分層現象。而保存在室溫下的樣本， 24 h未見任何變化， 3～6個月時出現少許混濁， 震蕩后樣本恢復均一外觀， 未見藥物結晶析出。

2. 3 不同制劑的POD對H8細胞的增殖抑制作用 POD-BE組和POD組均呈劑量和時間依賴性地抑制H8細胞的增殖。在相同濃度同一時間條件下， POD-BE組對H8細胞的增殖抑制效果明顯強于POD組， 差異具有統計學意義（P<0.01）。見圖2。POD-BE 組12、24、48 h的IC50分別為782、595、97 μg/L， 而POD組的IC50則分別為1966、1570、758 μg/L；空白BE組對細胞無明顯毒性。

2. 4 POD-BE和POD 誘導H8細胞調亡 與空白對照組相比， POD-BE組和POD組均能明顯誘導H8細胞凋亡（P<0.01）；然而POD-BE組誘導凋亡的效果則顯著強于POD組（P<0.01）。見表1， 圖3。

2. 5 POD-BE 誘導H8細胞調亡的形態學變化 10 μg/L的POD-BE和POD分別處理H8細胞24 h后， 透射電鏡下顯示：H8細胞被藥物處理后其染色質高度凝聚、邊緣化， 形成凋亡小體。見圖4。

2. 6 LCSM觀察POD-BE和POD在細胞的俘獲分布 H8細胞分別被POD-BE和POD處理24 h后， 兩組的熒光均表現出聚集于細胞核的趨勢， 且POD-BE組較POD組熒光信號強度顯著增強， 而空白BE組和空白對照組未見有陽性熒光信號表達。見圖5。

3 討論

與脂質體不同的是， 醇質體的囊泡里含有較高濃度的乙醇， 既具備脂質體刺激性小、緩釋及良好的靶向性等優點， 又克服了脂質體的包封率低、長期貯存藥物易于泄露等缺點[6]。而在其處方中引入丙二醇， 則演變成二元醇質體， 既可減少乙醇的含量， 又進一步增加它的穩定性[4]。于燕燕等[7]發現， 與0.5% POD酊劑相比， 0.35% POD-BE具有較大的皮膚滯留量及較小的透皮速率， 提高了用藥安全性。作者前期的研究已經證實， POD納米制劑對特定組織表現出良好的靶向性和緩釋性， 可大大降低CA的復發率[8， 9]。故推測， 采用BE包裹POD后， 有望增強POD在黏膜組織的局部濃集效果， 清除宮頸HPV潛伏感染， 減少宮頸CA的復發。

納米制劑的理化特性與該制劑所使用的材料、制備方法等有關。本研究采用超聲注入法研制POD-BE， 顯示出良好的理化特性， 其粒徑僅為（84.6±9.2）nm， 包封率高達（86.3±2.3）%， 且在室溫下保存 60 d后， 仍有較好的穩定性。其主要原因可能是：乙醇的添加使醇質體表面帶上了負電荷， 從而使粒子間不易聚集[10]；膽固醇的加入可有效增加醇質體磷脂雙分子層的韌性， 從而使醇質體具有更小的粒徑[11]；乙醇聯合丙二醇， 可有效增加藥物的溶解性及制劑的穩定性[12]， 這也較好地解決了脂質體在常溫下不穩定這一難題。

H8細胞株因含有HPV16型 E6和E7基因， 且將其接種到裸鼠不能形成腫瘤， 可作為體外研究宮頸HPV感染和癌前病變的細胞模型。本實驗以H8細胞作為靶細胞， 旨在研究POD-BE對細胞的增殖抑制和凋亡誘導效應。本研究結果顯示， 與POD組相比， POD-BE組對H8細胞具有更強的增殖抑制和凋亡誘導效果， 可能在于BE的成分與細胞膜的成分比較相似， POD被其包裹后， 更容易被細胞通過胞飲、膜融合等方式攝入細胞， 并緩慢地釋放， 從而使細胞內的藥物濃度得以顯著提高。LCSM下發現H8細胞被藥物處理后熒光表現出聚集于細胞核的趨勢， 與POD組相比， POD-BE組的核內熒光強度更強， 這也支持了作者的推測， 熒光強度不同提示二者在細胞的分布和轉化可能會不同， 作者會在將來的研究中進一步去論證。

綜上所述， 采用超聲注入法制備 POD-BE， 成功率高， 制備的樣品具有粒徑小、分布均勻、包封率高、穩定性好的特點。體外藥效學研究表現出較好的抗宮頸HPV感染和治療宮頸癌前病變的效果， 為下一步研究奠定了基礎。

參考文獻

[1] Walboomers JM， Jacobs MV， Manos MM， et al. Human papillo-mavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. Journal of Pathology， 1999， 189（1）：12-19.

[2] Goindi S， Dhatt B， Kaur A. Ethosomes-based topical delivery system of antihistaminic drug for treatment of skin allergies. J Microencapsul， 2014， 31（7）：716-724.

[3] 朱曉亮， 曾抗， 李國鋒， 等. 脂質體鬼臼毒素混懸液的制備及包封率測定. 中國醫院藥學雜志， 2005， 25（6）：569-570.

[4] 王軍， 何文. 酮洛芬二元醇質體凝膠的研制及其質量考察. 中國藥師， 2012， 15（6）：780-782.

[5] 肖順漢， 姚健， 劉明華， 等. 皂角刺總黃酮誘導HCT116細胞凋亡的透射電鏡觀察. 瀘州醫學院學報， 2010， 33（2）：116-118.

[6] Godin B， Touitou E. Erythromycin ethosomal systems： physicochemical characterization and enhanced antibacterial activity. Current Drug Delivery， 2005， 2（3）：269-275.

[7] 于燕燕， 趙繼會， 馮年平， 等. 鬼臼毒素醇質體的體外經皮滲透特性研究. 中草藥， 2012， 43（1）：74-77.

[8] 曾抗， 張三泉， 江彬彬， 等. 脂質體鬼臼毒素混懸液在大鼠表皮及真皮的分布規律初探. 中華皮膚科雜志， 2003， 36（6）：329-331.

[9] 謝方明， 曾抗， 陳志良， 等. 鬼臼毒素固體脂質納米粒凝膠治療復發性尖銳濕疣的隨機雙盲對照研究. 南方醫科大學學報， 2007， 27（5）：657-659.

[10] Meng S， Chen Z， Yang L， et al. Enhanced transdermal bioavailability of testosterone propionate via surfactant-modified ethosomes. Int J Nanomedicine， 2013（8）：3051-3060.

[11] Li G， Fan C， Li X， et al. Preparation and in vitro evaluation of tacrolimus-loaded ethosomes. Scientific World Journal， 2012（2012）：874053.

[12] Zhang JP， Wei YH， Zhou Y， et al. Ethosomes， binary ethosomes and transfersomes of terbinafine hydrochloride： a comparative study. Arch Pharm Res， 2012， 35（1）：109-117.