內生真菌HND5揮發性物質組分分析及其抑菌作用測定

陳奕鵬 楊揚 時濤 蔡吉苗 黃貴修

摘 要 HND5是從健康的臂形草葉片中分離得到的一株頂孢霉屬（Acremonium sp.）內生真菌，可通過產生揮發性物質抑制病原菌生長。采用頂空固相微萃取技術（HS-SPME）提取富集了內生真菌HND5的揮發性有機物（VOCs），利用氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）進行了揮發性物質的組分分析，共分離鑒定得到14個單體化合物。活性分析發現，石竹烯（Caryophyllene）和4-乙烯基-1，2-二甲氧基苯（Benzene，4-ethenyl-1，2-dimethoxy-）具有抑菌活性，對峙試驗表明2種物質均對尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、膠胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）具良好的抑制作用，其中石竹烯的有效中濃度（EC50）分別為2 916.07、729.54和404.23 μL/L，4-乙烯基-1，2二甲氧基苯的有效中濃度（EC50）分別為62.72、27.60和23.54 μL/L。

關鍵詞 內生真菌；揮發性有機物；氣相色譜-質譜聯用；抑菌作用

中圖分類號 S432.1 文獻標識碼 A

Abstract Endophytic fungi HND5 which was isolated from healthy leaves of Brachiaria sp. could inhibit many plant pathogens with volatile substances. In this article，solid phase micro-extraction（SPME）was used to collect volatile organic compounds（VOCs）produced by HND5 from the head space. And GC-MS was used to analyzed the volatile compounds of HND5. At last， 14 compounds were identified from VOCs produced by HND5. Within these compounds， Caryophyllene and Benzene， 4-ethenyl-1，2-dimethoxy- were found antagonistic against growth of Fusarium oxysporum， Colletotrichum gloeosporioides and Corynespora cassiicola. EC50 values of Caryophyllene were 2 916.07， 729.54 and 404.23 μL/L， respectively. And EC50 values of Benzene， 4-ethenyl-1，2-dimethoxy were 62.72， 27.60 and 23.54 μL/L， respectively.

Key words endophyte； volatile organic compounds； GC-MS； fungistasis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.04.016

使用化學藥劑是控制農作物病害的有效方法，但化學殺菌劑污染環境，誘導病菌抗性增強，破壞生態平衡及化學殘留問題亦令人擔憂，因此植物病害的生物防治研究越來越受到人們的重視。植物內生真菌（endophytic fungi）是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織和器官內部或細胞間隙，并在植物組織內不引起明顯組織變化的真菌[1]。研究表明內生菌可與宿主的長期共處，二者可形成互利的共生關系[2]。部分內生真菌可以在植物體內產生多種生物學反應，可以提供植物生長所需化學物質及激素[3]，參與植物的防衛反應[4]，促進植物快速增長[5]，增強植物抗逆、抗病害、抗蟲害的能力[6]。近年來，利用有益內生真菌進行植物病害的防治已成為研究熱點，內生菌可以通過產生抗生素或其他次級代謝產物誘導或增加宿主防御機制或者直接抑制甚至殺死病原菌[7-8]。HND5是本實驗室從珊狀臂形草中分離獲得的一株內生真菌，經形態學和分子鑒定，該菌屬枝頂孢屬（Acremoniu sp.）真菌[9]，體外抗性分析實驗結果表明，該菌株對多種重要病原真菌具有明顯的抑菌活性，并能誘導宿主植物產生耐鹽堿性[10]。且研究發現該菌株產生的揮發性有機物（VOCs）對多種重要病原真菌同樣具有抑制作用[11]，但關于VOCs種類及其具體活性物質等方面未見相關研究報道。

本研究采用頂空固相微萃取技術（HS-SPME）萃取了HND5產生的揮發性氣體，采用氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）進行了其揮發性物質的組分分析，并以尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、膠胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和多主棒孢病菌（Corynespora cassiicola）3種常見的植物病原真菌為靶標菌，測定了石竹烯和4-乙烯基-1，2二甲氧基苯2種單體化合物對這3種病原菌菌絲生長的熏蒸抑制作用，為今后HND5應用于植物病害的生物防治以及相關農藥制品的研發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 內生真菌HND5及植物病原真菌香蕉尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）Foc4、節瓜膠胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）T43和橡膠樹多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）CC01均由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所提供。

1.1.2 培養基和試劑 菌株培養采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA），配方參照方中達的方法[12]。石竹烯（98.5%）和4-乙烯基-1，2二甲氧基苯（工業純）購自Sigma-Aldrich公司，其它試劑均為國產分析純。

1.1.3 儀器設備 氣相色譜Agilent 7890A、質譜Agilent 5975均為Agilent（Palo Alto，CA）公司產品；SPME探頭（100 umol/L，PDMS）均購自Supelco（Bellefonte，PA）；石竹烯（98.5%）和4-乙烯基-1，2二甲氧基苯（工業純）均購自Sigma-Aldrich（Vienna，Austria）。

1.1 方法

1.2.1 揮發性有機物的吸附和解吸 揮發性有機物的吸附和解吸參照張冬靜[13]的方法，并加以改進：在帶橡膠塞的100 mL頂空瓶中倒入約30 mL PDA培養基制成斜面；將HND5菌株經平板活化后，接種至頂空瓶中，塞緊橡膠塞并用石蠟封口膜封口以保證頂空瓶的密封性，以不接HND5菌餅的PDA培養基為對照，置于28 ℃恒溫培養7 d；將固相微萃取頭在氣相色譜儀進樣口經250 ℃老化30 min后，將固相微萃取裝置針頭穿透橡膠塞插入試劑瓶內HND5菌落上方，固定好萃取裝置的手柄，小心推出纖維頭并計時，吸附30 min后取出并隨即插入GC-MS進樣口，250 ℃下熱脫附3 min。

1.2.2 GC-MS分析 色譜條件：使用的色譜柱為Agilent HP-5MS；色譜程序：60 ℃ 2 min；10 ℃/min升至100 ℃；5 ℃/min升至180 ℃；10 ℃/min升至240 ℃；240 ℃保持5 min。質譜條件：EI 70 eV，離子源230 ℃，四級桿150 ℃，35～800 amu全掃描。

1.2.3 揮發性物質的熏蒸抑菌作用測定 揮發性物質對植物病原真菌菌絲生長的熏蒸抑制作用測定采用菌絲生長速率法[14]，根據揮發性物質的使用劑量分別設5個濃度梯度處理，石竹烯每皿分別為10、20、40、80、160 μL（實際濃度分別為111.11、222.22、444.44、888.89、1777.78 μL/L）；4-乙烯基-1，2-二甲氧基苯每皿分別為1、5、10、20、40 μL（實際濃度分別為11.11、55.56、111.11、222.22、444.44 μL/L），并以無菌水為空白對照，重復3次；5 d后觀察病原真菌菌落生長情況，并采用十字交叉法測定其菌落直徑，計算其抑制率。

抑菌率/%=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100。

進行濃度計算時，將使用濃度（μL/皿）按以下公式換算成實際濃度（μL/L）：實際濃度=（使用濃度×1 000 mL）/培養皿容積90 mL。計算濃度對數（x）與抑制菌落生長百分率的幾率值（y），利用最小二乘法分別求得各殺菌劑對該菌的毒力回歸方程y=a+bx和EC50。

2 結果與分析

2.1 內生真菌HND5揮發性有機物GC-MS分析

分別將萃取的含HND5菌株和PDA的揮發性有機物和僅有PDA揮發性有機物的SPME萃取頭直接進樣進行GC-MS分析，總離子流圖見圖1。利用色譜峰面積歸一法測得各組分的相對含量，質譜圖經NIST11質譜數據庫檢索，與標準圖譜比對并結合化學物質登錄號（CAS號）分析，按照CPS（counts per second）>105，鑒定可信度大于90%的標準，得到14種HND5產生的揮發性有機物（表1），可分為烷烴類（2種），烯烴類（4種），酮類（1種），芳香族化合物（3種），氨基丙胺類（1種），萘衍生物（2種），哌啶類（1種）。其中，4-乙烯基-1，2二甲氧基苯的同系物4-甲氧基苯乙烯曾被報道具有抗菌活性，萘衍生物的同系物也在Muscodor albus產生的抗菌揮發性物質中被發現，石竹烯也存在于多種中藥揮發油中，關于其他揮發性物質的抗菌活性則少見報道[15，19，23]。據此，將對石竹烯、4-乙烯基-1，2二甲氧基苯和萘衍生物進行活性測定，但由于未能購置到相關試劑，僅使用石竹烯（Caryophyllene）和4-乙烯基-1，2二甲氧基苯2種物質的商品化純品進行了后續實驗。

2.2 內生真菌HND5揮發性有機物對病原真菌的熏蒸抑制作用

石竹烯（Caryophyllene）和4-乙烯基-1，2二甲氧基苯（Benzene，4-ethenyl-1，2-dimethoxy-）對3種病原真菌菌絲生長的抑制率見表2、表3和圖2。從表2、表3可以看出，2種揮發性物質對供試菌株菌絲生長均具有一定抑制作用，且抑制作用均隨劑量增加而增強，其中40 μL/皿石竹烯對膠胞炭疽菌和多主棒孢菌的抑制率即可達到50%以上；但其對尖孢鐮刀菌的抑制效果相對較差，在160 μL/皿的劑量下其抑制率為38.16%。4-乙烯基-1，2二甲氧基苯的抑菌效果較石竹烯好，在5 μL/皿的劑量下其對膠胞炭疽菌和多主棒孢菌抑制率即可達到60%以上；在10 μL/皿的劑量下其對尖孢鐮刀菌的抑制率也達到60%以上；在40 μL/皿的劑量下，該物質對3種病原菌的抑制率均達到了80%以上，其中對多主棒孢菌的抑制率達到了91.32%。

表4顯示，2種揮發性物質對病原真菌的生長均具良好的抑制作用，其中石竹烯對多主棒孢病菌的抑制作用最強，EC50僅為404.23 μL/L；其次為膠胞炭疽菌，EC50為729.54 μL/L；對尖孢鐮刀菌的抑制作用相對較弱，EC50為2916.07 μL/L。4-乙烯基-1，2二甲氧基苯對多主棒孢菌的抑制作用最強，EC50僅為23.54 μL/L；其次為膠胞炭疽菌，EC50為27.60 μL/L；對尖孢鐮刀菌的抑制作用相對較弱，EC50為62.72 μL/L。

3 討論

HND5是分離自臂形草的內生真菌，根據形態與分子鑒定，該菌株屬于頂孢霉屬（Acremonium sp.）。前期的研究發現，該菌株具有促進香蕉植株生長、提高香蕉植株耐鹽堿能力，能夠有效抑制多種病原菌的生長，是一株良好的生防菌株。時濤等[11]發現HND5可以通過產生揮發性物質抑制多種植物病原菌的生長，但揮發性物質的具體種類與有效成分尚未明確。固相微萃取是研究菌株揮發性產物的新方法，由于萃取方法簡單，時間短，是目前微生物揮發性有機物研究中最常使用的方法之一[15]。在本研究中，使用了頂空固相微萃取的方法收集HND5菌株的揮發性產物，結合GC-MS技術，全面并深入地分析了內生真菌HND5揮發性物質的種類，結果發現HND5共產生了14種揮發性物質，包括烯烴類芳香族，酚類。由于無法全部購買到商品化的純品，只對2種物質石竹烯（占總物質產量8.99%）和4-乙烯基-1，2二甲氧基苯（占總物質產量26.80%）進行了活性鑒定，僅占總揮發性物質產量的35.79%，結果證明這2種物質對3種植物病原真菌均具有較好的抑菌活性。

石竹烯存在于許多具有抗炎、抑菌、抑制哮喘功能的中草藥揮發油中[16]。同時，在很多具有抗菌功能的植物提取物中，也存在大量的石竹烯，如降香揮發油中石竹烯的含量占54.22%，紅葉李莖揮發油中石竹烯占8.57%，海南黃芩揮發油中石竹烯占7.92%等等[17-19]，但大多數研究僅分析了植物揮發油的抗菌活性，對其中的單體組分的活性沒有進一步分析。本研究發現石竹烯具備一定的抗菌活性，由此推斷石竹烯可能與一些植物揮發油的抗菌活性相關。4-乙烯基-1，2二甲氧基苯是HND5合成的分泌量最大的揮發性物質，占總量的26.80%，其抑菌活性也較石竹烯好，是HND5主要的揮發性抗菌物質。與石竹烯不同，4-乙烯基-1，2二甲氧基苯僅有少量同系物的相關抑菌活性報道。Wu等[20]曾在Streptomyce albulus NJZJSA2菌株中發現其同系物4-甲氧基苯乙烯具有拮抗尖孢鐮刀菌FOC4的活性，該物質能破壞細胞膜，導致菌絲縊縮和細胞內容物外溢，孢子頂端也出現了穿孔等現象。和4-甲氧基苯乙烯相比，4-乙烯基-1，2二甲氧基苯抑菌活性更高，并具有更廣的抑菌譜，具有進一步開發利用的良好前景。在沒有進行活性鑒定的物質中，萘衍生物是主要的部分，共有2種，占總揮發性物質總量的23.66%。內生真菌Muscodor albus能夠產生多種萘衍生物，抑制Pythium ultimum、Ustilago hordei和Fusarium solani等多種病原真菌[21]。衣蘭油烯也是HND5揮發性物質的主要部分，占總量的12.95%，衣蘭油烯經常在植物和中草藥揮發油中被發現，如藿香、連翹、日本常山等等，但對其沒有進行抑菌活性的相關研究[22-24]。

綜上所述，本研究從內生真菌HND5產生的揮發性物質中得到了2種對多種病原真菌具有良好拮抗活性的單體組分，石竹烯和4-乙烯基-1，2二甲氧基苯，為之后香蕉枯萎病、瓜菜炭疽病、橡膠棒孢霉落葉病等植物真菌病害防治藥劑的研發提供了前體和理論依據。此外，微生物代謝產生的揮發性物質的抑菌防病作用可能是一種或幾種物質的單一行為，也可以是眾多揮發物質協同作用下的群體效應。HND5產生的揮發性物質具良好的抑菌活性，亦可能是多種抑菌組分協同作用的結果，其具體的抑菌機理，也有待進一步研究分析。

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