重金屬污染土壤微生物多樣性研究方法

李焱+李云云

摘 要：該文主要對近年來重金屬污染土壤微生物多樣性的研究方法進行歸納概括，并對各自的優缺點以及適用情況進行分析，對微生物的研究方法進行了展望。

關鍵詞：重金屬污染；土壤微生物；微生物多樣性；研究方法

中圖分類號 X172 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）13-0036-03

Study on Soil Microbial Diversity in Heavy Metal Contaminated Soil

Li Yan1 et al.

（1Anhui Huajing Resources and Environment Technology Co.，Ltd.，Hefei 230094，China）

Abstract：In this paper，the research methods of microbial diversity of heavy metal contaminated soils in recent years are summarized，and their advantages and disadvantages and their application are analyzed. The research methods of microbes are also discussed.

Key words：Heavy metal pollution；Soil microbes；Microbial diversity；Research methods

近年來，由于農藥、化肥的大量使用，以及冶金、采礦業的迅猛發展，土壤重金屬污染日趨嚴重[1]。重金屬污染不僅會嚴重影響農產品以及農作物的品質，而且會通過食物鏈進入人體，危害人體健康。土壤是微生物棲息的最重要環境之一，提供了微生物生長所必要的營養物質。土壤微生物種類十分豐富，主要分為細菌、真菌、古菌以及放線菌等。土壤微生物是土壤有機質以及土壤養分C、N、P、S等循環轉化的動力，參與土壤中有機質的分解、腐殖質的形成、土壤養分的轉化循環等[2]。土壤微生物在土壤生態系統中扮演者十分重要的角色[3]，對環境的變化反應靈敏[4]，其群落多樣性和相對組成，是評價環境質量的重要參數[5]。一旦土壤生態系統受到污染，土壤微生物就會發生相應的變化[6]。有研究報告指出，土壤重金屬污染能明顯影響土壤微生物的活性及結構[7]，李晶等[8]研究也表明，土壤微生物對重金屬脅迫特別敏感，可通過微生物群落結構的變化來反映土壤質量和健康狀況[9]。因此，研究土壤微生物具有十分重要的意義。本文對研究微生物傳統以及各種新型研究方法進行了分類介紹，并對各種方法的優缺點以及適用場合進行說明。

1 土壤微生物研究方法

1.1 傳統的分離純培養和稀釋平板計數 在固體瓊脂培養基上接種培養微生物，可利用微生物的表面特征差異，在固體培養基上對微生物進行分離純化，也可利用該方法對微生物在平板上進行簡單的計數[10]。同時可以通過配制不同成分的培養基對微生物進行篩選馴化，從而得到我們需要的菌種。此種方法的優點是成本低，便于對微生物的狀況做出初步的判斷。缺點是由于自然界中存在大量的不可培養的微生物，且存在很多對溫度要求苛刻并微生物，如嗜低溫菌和嗜高溫菌，傳統的固體培養基的培養溫度并不能滿足這些微生物的生存所需溫度。

1.2 Biolog微平板法 Biolog微平板原理是基于測定微生物對單一碳源利用程度的差異來表征微生物的生理特性[11]。Biolog微平板由對照孔和95種不同單一碳源孔組成并在其中添加染料，當接種純培養的菌液時，其中一些孔的營養物質被利用，使各孔呈現出不同的顏色，從而形成微生物特有的代謝指紋，可通過與標準菌種的數據庫做對比，從而可鑒定出被測菌種。與傳統培養方法相比，此方法可以估算微生物群落代謝多樣性和功能多樣性。同時可根據各孔的顏色差異來反映出微生物群落的均勻度，從而可以反映出群落的穩定性[12]。該方法的缺點是當環境差異不大時，這些指數并不能較敏感地區分菌群之間的差異[13]。同時由于不同的生長和競爭的結果，菌種之間會相互影響導致種群發生變化，影響測定結果[14]。

1.3 磷酸脂肪酸分析法（PLFA） 磷酸脂肪酸存在于活細胞的細胞膜中，具有屬的特異性，不同屬的微生物通過不同生化途徑而形成不同的磷酸脂肪酸（PLFAs）[15]。因此，土壤中的PLFAs組成和含量變化在一定程度上可反映土壤中微生物量和群落的動態變化。通過對微生物的磷酸脂肪酸進行提取，并依據其中的特征脂肪酸指示的微生物種類[16]，可對土壤中微生物群落特征進行表征。此種方法具有對試驗條件要求低、無需對微生物進行培養、測試功能多和穩定性好等優點[17]。但PLFA法也具有一定的局限性。該方法只能鑒定到屬，PLFA圖譜并不能給出一個實際的微生物種類組成，僅能反映微生物群落的概圖[18]；另外，該方法容易受微生物生理狀態影響[19-20]；古菌不能使用PLFA圖譜進行分析，因為它的極性脂質是以醚而不是以酯鍵的形式出現[21]。同時由于目前尚未建立土樣中所有微生物的特征脂肪酸，并且在很多情況下，還無法確定土樣中某些脂肪酸與特定微生物或微生物群落的對應關系[22]。

1.4 變性梯度凝膠電泳技術（PCR-DGGE） 該技術是以復雜的環境樣品如土壤為研究對象，直接提取微生物DNA，利用通用引物進一步對提取的DNA進行PCR擴增。將擴增產物開展DGGE凝膠電泳分析[23]。DGGE不是將分子量不同的DNA分開，而是通過聚丙烯酰胺凝膠中變性劑濃度梯度的不同，將序列不同的DNA分開[24]。該方法的原理是根據DNA的解鏈特性，不同堿基組成的DNA雙螺旋發生變性所需要的變性劑濃度不同。在普通的聚丙烯酰胺凝膠基礎上加入變性劑，根據其遷移行為決定于其分子大小和電荷的原理能夠將長度相同但序列不同的DNA片段區分開[25]。該方法具有可靠性高、重現性強、方便快捷、分辨率高等優點[26]，但同時也存在一定的局限性。DGGE還不能全面分析土壤中全部微生物，該方法只能檢測出土壤中相對豐度大于1%的微生物[27]；同時DGGE對實驗要求較高，凝膠濃度、溫度、電壓等電泳條件選擇不當時，就會發生共遷現象[26]，即同一條帶不止包含一種微生物，微生物的種類被低估。

1.5 高通量測序技術 高通量測序技術也稱“下一代”測序技術，1次并行能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定。以Illumina公司的Solexa，ABI公司的SOLiD，和Roche公司的454技術為代表[28-29]。該技術對于研究土壤微生物具有極大的意義。該技術極大地降低了微生物測序成本，實驗了大規模土壤微生物直接測序[30]；同時該方法極大地提高了測序通量，豐富了研究的信息量，便于研究者更加深入地了解所研究課題。但同時該方法也存在一定的局限性，主要局限性如下：海量數據分析難的問題，該測序方法所測數據之深，所獲信息之大，都極大地加大了實驗研究者分析數據的難度；數據去偽存真難的問題，在土壤微生物高通量測序中，存在物種豐富度被高估的情況[30]，對高通量測序結果去偽存真，探索新的統計學方法成為研究者面臨的一大難題[31]。

1.6 基因芯片技術（GeoChip） 基因芯片（GeoChip）是研究土壤微生物非常有效的技術手段，作為新一代的核酸雜交技術，可用于檢測環境微生物參與物質循環、污染物降解等過程中參與的功能基因[32]。該方法是在芯片上含有編碼各種與生態學和生物功能過程或生物降解作用有關酶的基因[33]。由此可見，功能基因芯片為土壤微生物研究提供了全新強有力的技術分析工具，有利于更加有效地利用微生物對污染土壤進行修復[34]。基因芯片技術具有高密度、高靈敏度、自動化和低背景水平等顯著優點[35]。但是任何技術都存在一定的局限性，基因芯片技術也不例外。該技術雖能檢測出微生物在生物學過程中所發揮作用的功能基因，但是卻不能直接表征微生物的群落多樣性組成和豐富度。應結合DNA與mRNA測序，可以更加真實全面地反映土壤微生物群落結構信息及其生理活動[34]。同時該方法在取樣、標記、雜交條件、圖像處理、數據歸一化以及所得數據的質量評估等都會帶來很多誤差[36]。

2 不同方法在重金屬污染土壤中的應用

劉云國等[37]在湖南臨鄉桃林礦區土壤中采用稀釋涂布法在馬丁固體培養基上篩選出一株高抗銅、鋅菌株；張秀等[38]利用Biolog微平板法來分析生物質炭對鎘污染土壤微生物多樣性的影響；孫婷婷等[39]利用磷酸脂肪酸分析法來分析羥基磷灰石-植物聯合修復對Cu/Cd污染植物根際土壤微生物群落的影響；鄭涵等[40]利用PCR-DGGE分析方法對鋅脅迫對土壤中微生物群落變化的影響進行了評價分析；江玉梅等[41]利用Illumina平臺高通量測序技術分析重金屬污染對鄱陽湖底泥微生物群落結構的影響；路桃香對植物非根際土壤微生物進行454高通量測序。

目前對于微生物研究方法有很多種，有最先進的技術，也有傳統的實驗方法，每種方法都各有優缺點，因此，在研究土壤微生物時，應結合土壤特征以及研究目的合理選擇研究方法。如條件允許的情況下，可以結合多種技術方法同時使用，可以更好地研究土壤微生物的群落特征。

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（責編：張宏民）