紅藻氨酸致癲癇大鼠腺苷酸激酶2表達變化的研究

王晶+殷亮++++++呂涌濤++++++馮肖亞

[摘要] 目的 研究紅藻氨酸（KA）致大鼠顳葉癲癇（TLE）后腺苷酸激酶2（AK2）的表達變化，探討AK2參與顳葉癲癇的發病機制。 方法 將60只雄性SD大鼠分為正常組（10只）和模型組（50只），模型組建立TLE模型；按致癇后6 h、12 h、1 d、3 d、1周對模型組再次進行分組，每組各10只。利用半定量RT-PCR法及Western bloting技術檢測AK2 mRNA及蛋白在大鼠額葉及海馬中的表達變化。 結果 致癇后額葉及海馬組織中AK2 mRNA及蛋白表達均較正常組明顯升高（P < 0.05）；致癇后3 d組AK2 mRNA及蛋白含量達到高峰，致癇后1周逐漸降低（P < 0.05）。 結論 AK2可能參與癲癇的發生機制，為癲癇發病機制提供新的依據。

[關鍵詞] 紅藻氨酸；癲癇；腺苷酸激酶2；線粒體；凋亡

[中圖分類號] R742.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）07（c）-0014-04

[Abstract] Objective To determine the expression levels of multifunction cytokine AK2 in kainic acid-induced epileptic rat， and to investigate whether AK2 participates in the pathogenesis of EP. Methods 60 male SD rats were divided into control group （10 cases） and model group （50 cases）， the animal model of temporal lobe epilepsy was established in model group by intra cerebroventricular injection of KA. Then the rats in the model group were divided into 6 hours group， 12 hours group， 1 day group， 3 days group and 1 week group， with 10 cases in each group， according to the different time points after seizures. AK2 mRNA and protein expression in frontal lobe and hippocampus tissue were measured by semi-quantitative RT-PCR and Western blotting. Results In the model group， expression levels of AK2 in both front al lobe and hippocampus tissue were significant increased compared with the control group （P < 0.05）. And the expression levels were reached the highest 3 days after seizures and then gradually declined 1 week later （P < 0.05）. Conclusion AK2 may participate in the pathophysiological process of EP and provide a new mechanistic basis for the pathogenesis of epilepsy.

[Key words] Kainic acid； Epilepsy； Adenylate kinase 2； Mitochondria； Apoptosis

癲癇是大腦神經元過度超同步化異常放電的慢性腦部疾病。其具有多樣性的發作形式和復雜的遺傳機制，目前對癲癇的發作機制認識還比較局限[1]。有研究發現腺苷酸激酶2（AK2）存在于細胞的線粒體內膜間隙中，線粒體在細胞的調亡過程中起著主要調控作用，表明腦內線粒體的功能障礙在癲癇的發病機制中起著重要作用[2-3]。本實驗在立體定向技術下在大鼠行側腦室注射紅藻氨酸建立TLE模型，通過行為學觀察癲癇發作后，大鼠額葉及海馬組織中的AK2 mRNA及蛋白在不同時間點的表達變化，以探討AK2是否參與癲癇發病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD健康大鼠60只，體重200～280 g，購自山東大學動物實驗中心，動物合格證號：0029760。飼養環境標準如下：24 h晝夜循環，恒溫23～25℃，恒濕50%～60%，避免噪音及強光照射、每只大鼠分裝于獨籠，在均可自由進食及飲水的條件下飼養。

1.2 分組

按隨機數字表法將大鼠隨機分成正常組（10只）、模型組（50只），按KA首次致癇后6 h、12 h、1 d、3 d、1周共5個時間段將模型組分為5組，每組各10只。

1.3 實驗方法

1.3.1 制作TLE模型 3.6%水合氯醛360 mg/kg對大鼠進行腹腔麻醉，使用立體定位儀將大鼠固定，備皮，消毒，鋪孔巾，沿頭部正中線切開皮膚，長度約1 cm，暴露前囟。按前囟后0.8 mm，右側旁開1.5 mm定位側腦室，電鉆鉆孔達硬腦膜表面，將KA（濃度為1 μg/μL）通過微量進樣器沿鉆孔進針4.5 mm，10 min內推注1 μL，緩慢拔除穿刺針。用消毒骨蠟封閉穿刺處后進行皮膚縫合，對每只大鼠均進行持續行為學觀察。按Racine分級標準（1972年）分為0～V級，Ⅲ級以上為成功造模。按上述方法對正常組大鼠進行麻醉后側腦室注射生理鹽水1 μL。

1.3.2 獲取腦組織 斷頭處死大鼠，于冰臺上迅速剝取出腦組織，分離出額葉及海馬組織，迅速置入凍存管中并于液氮中凍存。

1.3.3 半定量RT-PCR法 RNA 抽提：取約100 mg組織放于研磨器內，邊研磨邊加入液氮，將組織研磨成粉末狀，加入含有Trizol溶液的EP管中，在超聲破碎儀中給予充分混勻，置于冰上10 min。加入氯仿，用力充分混勻，置于冰上10 min。離心15 min，10 000 r/min。等體積異丙醇與上層水相混勻后置于-20℃冰箱中10 min，待能看見清楚分層后，離心10 min，10 000 r/min。留取白色沉淀，振蕩洗滌RNA，離心5 min，12 000 r/min。棄上清液，4℃冰箱內適度干燥RNA。通過檢測波長260 nm和280 nm的吸光度（OD）值，部分RNA進行完整性電泳。

AMV一步法RT-PCR檢測：以總RNA為模板逆轉錄得到cDNA。根據Primer 5.0軟件設計AK2引物序列，并已通過堿基局部對準檢索工具檢測：上游引物5′-GAAGGGGTTAGGGAACAAGC-3，下游引物5′-ATGGCAGCATTTGGTCAGTT-3′。β-actin 上游引物5′-AGATGACCCAGATCATGTTTGA-3′，下游引物5′-TTGGCATAGAGGTCTTTA-3′。反應條件：預變性90℃ 3 min，變性92℃ 30 s，退火60℃ 45 s，延伸80℃ 1 min，最后一次延伸75℃ 5 min，重復2～4次，共28個循環。

電泳：PCR產物進行電泳，通過凝膠圖象處理系統進行分析，計算出待測基因與β-actin OD比值作為待測基因mRNA的相對表達量，與正常組進行組間比較。

1.3.4 免疫印跡法 總蛋白的提取：取100 mg組織在含有液氮的研磨器中進行研磨，研碎至粉末狀后轉入干燥清潔EP管中，進行裂解粉碎后，離心30 min，10 000 r/min，將上清取出分裝于EP管中，凍存條件-80℃。

測定蛋白含量：按BCA試劑盒說明進行。

凝膠電泳：取總蛋白50 μg進行電泳。

轉膜：正確切割膠條后于轉膜緩沖液中進行平衡，按從下至上的順序：陽極碳板、2層濾紙、PVDF膜、凝膠、2層濾紙、陰極碳板，裝好轉膜裝置，并排空每層氣泡后進行轉膜。

免疫反應：轉膜后于脫色搖床上封閉1 h，加入AK2多克隆抗體（1∶500）進行雜交過夜，待洗膜后用HRP標記的二抗進行雜交。雜交后用再次洗膜。

顯影及定影：采用ECL化學發光法進行顯色。

凝膠圖象分析：用凝膠圖象系統處理，計算出待測蛋白與GAPDH蛋白OD比值作為待測蛋白的相對表達量，與正常組進行組間比較。

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學觀察

通過立體定位儀對大鼠進行側腦室注入KA后，10～30 min絕大部分大鼠癲癇發作，表現：如面部抽搐、節律性點頭動作、胡須抖動、肢體陣攣發作；1～3 h后出現癲癇持續狀態表現：反復出現雙側眼球凝視，伴咀嚼動作、口角流涎、面部抽搐及肢體陣攣、身體弓背向上、尾部向上高高翹起、反復出現站立跌倒等；6～8 h后癲癇發作頻次較前逐漸減少，持續時間較前縮短，1 d～1周后可出現間斷性癲癇發作。所有大鼠造模后分級（按Racine分級標準）：0級0只，Ⅰ級0只，Ⅱ級0只，Ⅲ級20只，Ⅳ級19只，Ⅴ級11只，均造模成功，且符合TLE模型標準。但術后出現5只大鼠全身強直陣攣發作，最終無法耐受最終死亡，其中包括Ⅴ級3只，Ⅳ級2只，再次按同樣方法造模成功5只大鼠，符合造模入選標準，且無死亡。生理鹽水組無上述異常，無死亡。

2.2 模型組大鼠額葉及海馬AK2 mRNA的表達

模型組大鼠額葉及海馬組織中AK2 mRNA的表達趨勢：從致癇后6 h開始逐步增高，3 d后可達高峰，1周后逐漸降低。模型組與正常組相比，額葉及海馬組織中AK2 mRNA在不同時間段的表達均顯著高于正常組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1。各組大鼠額葉及海馬AK2 mRNA結果見圖1。

2.3 模型組大鼠額葉及海馬AK2蛋白的表達

模型組大鼠額葉及海馬組織中AK2蛋白的表達趨勢：從致癇后6 h開始逐步增高，3 d后可達高峰，1周后逐漸降低。模型組與正常組相比，額葉及海馬組織中AK2 mRNA在不同時間段的表達均顯著高于正常組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。各組大鼠額葉及海馬AK2蛋白表達結果見圖2。

3 討論

癲癇的腦神經元高度同步化異常放電引起不同程度的神經功能障礙，具有刻板性、重復性、發作性[4]。額葉作為大腦發育中最高級的部分，包括初級運動區、前運動區和前額葉，主要功能與精神、語言和隨意運動有關。海馬主要與記憶以及空間定位有關[5]。既往實驗研究中顯示癲癇發作中凋亡相關基因大量表達，如P53等，引起神經元大量壞死、凋亡，導致神經元間重組細胞之間的突觸聯系[6-7]。目前提出凋亡途徑主要為：外源性途徑/死亡受體途徑和內源性途徑/線粒體途徑。線粒體作為分子靶點或整合元件參與細胞凋亡，在細胞凋亡過程中起著重要作用，是啟動細胞調亡的關鍵之一[8-9]。

AK是廣泛存在于動物體內細胞的單體酶，在維持細胞能量平衡起著主要作用，共有5種同工酶，AK2是一種線粒體蛋白，廣泛表達于細胞線粒體內膜間隙，并且參與細胞內AMP轉化為ADP的過程，影響ADP、ATP、dATP的生成水平，與核苷酸還原酶相關，在細胞凋亡過程中釋放到胞漿外[10-11]。在腦內ATP和GTP是腦細胞能量的主要來源，AK2作為一種嘌呤類神經遞質或調質存在，也作為營養因子調節神經系統的發育、增殖、凋亡及重塑[12-13]。細胞凋亡是多種細胞共同調控的為維持內環境穩定的細胞死亡過程，癲癇發作后腦內神經元細胞可發生明顯的壞死和凋亡，細胞調亡需要耗能，若線粒體輕度受損，所產生的ATP足夠維持凋亡所需的能量，神經元最終損傷后調亡；若線粒體受損嚴重，在缺乏ATP的情況下，神經元則無法啟動凋亡程序，最終發生壞死[14-15]。因此，癲癇發病機制中，因損傷的程度和細胞的能量狀態不同，凋亡和壞死的形態學特征可同時存在。近年來有研究表明AK2的酶活變化在細胞凋亡過程中起著重要作用，可能參與癲癇的發病機制[16]。

AK2作為一種神經遞質或調質，主要參與誘導神經元細胞壞死、凋亡，導致腦內異常放電，引起癲癇發作；還是在癲癇發作過程中，僅因線粒體功能障礙而引起其表達增高；以上問題仍需更多的實驗研究進一步研究證實。目前尚無AK2在致癇大鼠腦組織中的表達的實驗研究，本實驗結果表明，AK2從致癇后在額葉及海馬組織中表達即開始出現增高，3 d后達高峰，持續1周后開始緩慢下降，推測線粒體功能受損后AK2大量表達，介導腦內神經元細胞的凋亡過程，引起癲癇發作；癲癇的發作后出現線粒體功能障礙和超微結構改變，增加AK2在細胞胞漿中的表達，兩者相輔相承。腦內神經元細胞中的線粒體主要作用于ATP的合成，部分線粒體呼吸酶抑制也可引起癲癇的發作，其功能受到損傷后大量釋放AK2，AK2可作為RNA結合的非酶活性蛋白，在胞漿中與相應RNA結合后調節細胞凋亡轉錄過程，介導細胞凋亡的發生[17-18]。細胞內保持充足的ATP方能維持神經細胞的膜電位的穩定，AK2還可以通過引起ATP水平的下降及神經元Ca2+的動態失衡，影響神經元的興奮性和突觸傳遞，誘發癲癇發作[19-20]。這將為抑制癲癇發作的新治療途徑提供理論依據。

[參考文獻]

[1] Six E，Lagreslepeyrou C，Susini S，et al. AK2 deficiency compromises the mitochondrial energy metabolism required for differentiation of human neutrophil and lymphoid lineages [J]. Cell Death Dis，2015，6（8）：e1856.

[2] Rissone A，Weinacht KG，Marca GL，et al. Reticular dysgenesis-associated AK2 protects hematopoietic stem and progenitor cell develop ment fro m oxidative stress [J]. J Exp Med，2015，212（8）：1185-1202.

[3] Ebine K，Hirai M，Sakaguchi M，et al. Plasmodium Rab5b is secreted to the cytoplasmic face of the tubovesicular network in infected red blood cells together with N-acylated adenylate kinase 2 [J]. Malar J，2016，15（1）：323.

[4] Li D，Liu MS，Ji B. Mapping the Dynamics landscape of conformational transitions in enzyme：the adenylate kinase case [J]. Biophys J，2015，109（3）：647-660.

[5] Boonrueng C，Tangpranomkorn S，Yazhisai U，et al. Molecular cloning，subcellular localization and characterization of two adenylate kinases from cassava，Manihot esculenta Crantz cv. KU50 [J]. J Plant Physiol，2016，204：66-73.

[6] Lai Y，Hu X，Chen G，et al. Down-regulation of adenylate kinase 5 in temporal lobe epilepsy patients and rat model [J]. J Neurol Sci，2016，366：20-26.

[7] Russo E，Andreozzi F，Iuliano R，et al. Early molecular and behavioral response to lipopolysaccharide in the WAG/Rij rat model of absence epilepsy and depressive-like behavior，involves interplay between AMPK，AKT/mTOR pathways and neuroinflammatory cytokine release [J]. Brain Behav Immun，2014，42（4）：157-168.

[8] Peng X，Wang L，Chen G，et al. Dynamic expression of adenylate kinase 2 in the hippocampus of pilocarpine model rats [J]. J Mol Neurosci，2012，47（1）：150-157.

[9] Bashi ZD，Gyawali S，Bekkaoui D，et al. The Sclerotinia sclerotiorum Slt2 mitogen-activated protein kinase ortholog，SMK3，is required for infection initiation but not lesion expansion [J]. Can J Microbiol，2016，62（10）：836-850.

[10] Thieulin-Pardo G，Schramm A，Lignon S，et al. The intriguing CP12-like tail of adenylate kinase 3 from Chlamydomonas reinhardtii [J]. FEBS J，2016，283（18）：3389-3407.

[11] Ianiski FR，Rech VC，Nishihira VS，et al. Amyloid-β peptide absence in short term effects on kinase activity of energy metabolism in mice hippo campus and cerebral cortex [J]. An Acad Bras Cienc，2016，88（3 Suppl）：1829-1840.

[12] Wei D，Hurd C，Galleguillos D，et al. Inhibiting cortical protein kinase A in spinal cord injured rats enhances efficacy of rehabilitative training [J]. Exp Neurol，2016，283（Pt A）：365-374.

[13] Ali I，Boets S，Janssens P，et al. Metabotropic gluta mate receptor 2/3 density and its relation to the hippocampal neuropa thology in a model of temporal lobe epilepsy in rats [J]. Epilepsy Res，2016，127：55-59.

[14] Reeta KH，Prabhakar P，Gupta YK. Anticonvulsant activity of the anti depressant drug，tianeptine，against pentylenetetrazole-induced seizures mitigates cognitive impairment in rats [J]. Behav Pharmacol，2016，27（7）：1.

[15] Brewster AL，Marzec K，Hairston A，et al. Early cardiac electrographic and molecular remodeling in a model of status epilepticus and acquired epilepsy [J]. Epilepsia，2016，57（11）：1907-1915.

[16] Liang S，Zhang L，Yu X，et al. Neuroprotective effect of elect ric conduction treatment on hippocampus cell apoptosis in KA induced acute temporal lobe epileptic rats [J]. Brain Stimul，2016，9（6）：933-939.

[17] Dustin SM，Stafstrom CE. Ketogenic diet，but not polyunsaturated fatty acid diet，reduces spontaneous seizures in juvenile rats with kainic acid-induced epilepsy [J]. J Epilepsy Res，2016，6（1）：1-7.

[18] Liang LP，Patel M. Plasma cysteine/cystine redox couple disruption in animal models of temporal lobe epilepsy [J]. Redox Biol，2016，9（C）：45-49.

[19] Feng L，Shu Y，Wu Q，et al. EphA4 may contribute to microvessel remodeling in the hippocampal CA1 and CA3 areas in a mouse model of temporal lobe epilepsy [J]. Mol Med Rep，2017，15（1）：37-46.

[20] Clark TJ，Lu Y. Analysis of loss-of-function mutants in aspartate kinase and homoserine dehydrogenase genes points to complexity in the regulation of aspartate-derived amino acid contents [J]. Plant Physiol，2015，168（4）：1512-1526.