秦艽不同醇提物的抑菌作用比較

李軍++王紅燕++張燃++郝彩琴

[摘要]目的 考察秦艽不同醇提物對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌和福氏志賀菌的體外抑菌效果。方法 采用牛津杯法和試管二倍稀釋法聯合瓊脂平板法測定以無水乙醇、65%乙醇和水為溶劑的秦艽提取物對4種細菌的體外抑菌活性和最低抑菌濃度（MIC）。結果 3種秦艽醇提物中，65%乙醇提取物的抑菌效果最好，對糞鏈球菌和表皮葡萄球菌的抑菌作用較強，其MIC分別為7.83 g/L和15.63 g/L，對金黃色葡萄球菌的 MIC為62.50 g/L。結論 秦艽65%乙醇提取物對糞鏈球菌、表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性較強，為合理使用該類藥材提供實驗依據。

[關鍵詞]秦艽醇提物；抑菌活性；最低抑菌濃度；比較

[中圖分類號] R286.0 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）09（a）-0130-03

Comparison of antibacterial activities of different ethanol extracts from Gentianae Macrophyllae Radix

LI Jun WANG Hong-yan ZHANG Ran HAO Cai-qin▲

Department of Biological and Pharmaceutical Technology，Ningxia Polytechnic College in Ningxia Hui Autonomous Region，Yinchuan 750021，China

[Abstract]Objective To analyze the in vitro antimicrobial activities of different ethanol extracts from Gentianae Macrophyllae Radix to Staphylococcus aureus，Staphylococcus epidermidis，Enterococcus faecalis and Shigella flexneri.Methods Oxford cup method and two fold dilution test tube combined with agar plate method were used to determine the antibacterial activities in vitro and minimal inhibitory concentration （MIC） of different extracts with ethanol，65% ethanol and water as solvent of Gentianae Macrophyllae Radix on four kinds of bacteria.Results Three kinds of ethanol extracts of Gentianae Macrophyllae Radi had certain antibacterial effects on bacteria，and the 65% ethanol extract was the best one，which antibacterial activities to Enterococcus faecium and Staphylococcus epidermidis were stronger and MIC was 7.83 g/L and 15.63g/L separately.MIC of Staphylococcus aureus was 62.50 g/L.Conclusion 65% extracts of Gentianae Macrophyllae Radi have a stronger antibacterial activity for Enterococcus faecium，Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus，which provides the experimental basis for the rational use of this kind of medicinal herbs.

[Key words]Gentianae Macrophyllae Radix；Antibacterial activity；Minimal inhibitory concentration；Comparison

秦艽（Gentianae Macrophyllae Radix）為龍膽科龍膽屬多年生草本植物，為臨床常用中藥[1]，《中國藥典》2015 年版規定其來源為秦艽（Gentiana macrophylla Pall.）、麻花秦艽 （Gentiana straminea Maxim.）、粗莖秦艽（Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk.）和小秦艽（Gentiana dahurica Fisch.）的干燥根[2]。其主要化學成分有環烯醚萜苷類、黃酮類及三萜類、木脂素類和大葉苷等[3-5]。秦艽作為重要的傳統中藥之一，被列為中品，《神農本草經》記載其味苦、平，性微寒，可祛風濕、舒筋絡、清虛熱、利濕退黃[6]，為祛風濕、清熱之首藥。龍膽苦苷作為其主要活性成分具有抗菌、消炎、保肝利膽、健胃等生物活性[7-9]。目前，有關秦艽提取物的抑菌活性已有報道[10-11]，但有關不同濃度乙醇提取物對致病菌的抑菌活性比較未見報道。故本研究利用不同濃度乙醇提取秦艽有效成分測定其抑菌活性，進一步推測判斷其抑菌的活性部位或成分，以期為秦艽資源的進一步開發和利用提供理論依據。

1材料與方法endprint

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黃色葡萄球菌（ATCC25923），表皮葡萄球菌（ATCC12228），糞腸球菌（ATCC29212），福氏志賀菌（CMCC51572）均為寧夏醫科大學臨床醫學院檢驗中心楊秀琴老師饋贈。

1.1.2 藥品及試劑 秦艽藥材購自寧夏六盤山藥材種植有限公司，經張守宗高級農藝師鑒定為龍膽科植物秦艽（Gentiana macrophylla Pall），自然晾干，粉碎過藥典二號篩，備用。牛肉膏、蛋白胨和瓊脂均購于北京奧博星生物技術有限公司、無水乙醇（西安化學試劑廠）。

1.1.3 儀器與設備 EL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；RE-52A真空旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-III循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；DHP-9162智能型電熱恒溫培養箱（上海瑯軒實驗設備有限公司）；DHG-9123A電熱恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）；SHY-2A水浴恒溫振蕩器（常州國宇制造有限公司）；YJ-875型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；YXQ-LS-50S立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 秦艽不同溶劑提取物的制備 采用加熱回流法，分別以無水乙醇、65%的乙醇及水為溶劑進行提取。具體過程如下：稱取藥材粗粉50 g，按料液比（1∶6）加溶劑，先浸泡20 min，再加熱回流30 min，過濾，收集濾液，濾渣按料液比（1∶4）加溶劑，再加熱回流30 min，過濾，合并兩次濾液，在60℃以下減壓濃縮回收溶劑，所得浸膏用水溶解并轉移定容至50 ml容量瓶中，濃度相當于原藥材1 g/ml，置于4℃冰箱，備用。

1.2.2 菌株的活化和菌懸液的制備 將低溫保藏的糞腸球菌、表皮葡萄球菌、福氏志賀菌和金黃色葡萄球菌標準菌株接種于營養瓊脂培養基上，37℃ 培養過夜，觀察各菌株的生長情況并制片鏡檢有無雜菌污染?；罨蟮闹甘揪杲臃N到營養肉湯培養基中于搖床上 37℃ 恒溫震蕩培養 16 h，得到原菌液。通過比濁管比濁后，用無菌水稀釋成濃度為0.5麥氏單位（1.5×106 cfu/ml）的菌懸液備用。

1.2.3 不同提取物的抑菌活性測定 采用牛津杯法進行體外抗菌活性試驗。于營養瓊脂培養基平板表面接種50 μl菌懸液并涂布均勻。并用鑷子將無菌的牛津杯輕輕放入培養皿中，在水平放置的平皿中均勻地放置3只牛津杯。吸取一定濃度的抗菌藥物溶液0.2 ml至牛津杯中，注意不要溢出牛津杯外。37℃培養16～24 h。觀察結果，并用游標卡尺測量抑菌圈直徑（mm）。平行進行3次試驗，以3次結果相同為準，抑菌圈直徑結果以3次的平均值進行計算。根據抑菌圈的大小，初步判斷細菌對藥物的敏感性。抑菌效果判定：抑菌圈直徑>20 mm為極敏感，>15～20 mm為高度敏感，10～15 mm為中度敏感，抑菌圈<10 mm為低度敏感[12]，“-”為無抑菌活性。

1.2.4 最小抑菌濃度（MIC）測定 采用試管二倍稀釋法聯合瓊脂平板法進行提取物MIC測定[13-15]。 取無菌試管10支，排成一排，除第一管外，其余每管加入營養肉湯0.5 ml，在第1管和第2管加入秦艽提取物原液0.5 ml并混勻，然后從第2管吸取0.5 ml加至第3管，混勻后再吸取0.5 ml加至第4管，如此連續倍比稀釋至第9管，并從第9管中吸取0.5 ml棄去，第10管為不含藥物的生長對照。最后在每管內加入上述稀釋好的菌液各0.5 ml，使每管最終菌液濃度約為5×105 cfu/ml。第1管至第9管藥物濃度分別為250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98 mg/ml。另設陽性對照（試驗菌株+營養肉湯）、陰性對照（營養肉湯）。置37℃培養箱培養18～24 h。由于中藥液的色澤渾濁，需采用瓊脂平板法觀察結果（具體步驟參照文獻[10]）。

2結果

2.1不同提取物對不同菌株的抑菌活性

從表1得知，以無水乙醇、65%乙醇和水為溶劑的秦艽提取物對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和糞腸球菌均有不同程度的抑制作用。而對福氏志賀菌基本沒有抑制作用。從不同提取溶劑看，65%乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和糞腸球菌極敏感，其抑菌圈直徑達到25.1、27.6、34.2 mm，無水乙醇提取物對表皮葡萄球菌和糞腸球菌高度敏感，而水提取的抑菌效果比65%乙醇和無水乙醇提取物的抑菌效果弱一些。從不同提取液的濃度看，各個質量濃度秦艽提取物均對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌有抑菌作用，且藥液濃度越高，抑菌效果越好，具有劑量依賴性。但其提取物抑菌機制有待進一步探討。由于上述三種提取物對福氏志賀菌的基本沒有抑菌活性，故以下MIC試驗未選取福氏志賀菌作為受試菌株。

2.2不同提取物對不同菌株的最小抑菌濃度

由表2可以看出，秦艽65%乙醇提取物對表皮葡萄球菌和糞腸球菌的抑菌效果較好，其MIC為15.63、7.83 g/L。水提取物對表皮葡萄球菌和糞腸球菌的MIC相同，為31.25 g/L。無水乙醇提取物對糞腸球菌的MIC較低，與65%乙醇提取物相同。而三種提取物對金黃色葡萄球菌的MIC相對較高，為62.5 g/L以上。

3討論

近年來，濫用抗生素導致細菌耐藥性不斷增強，抗生素耐藥已經引起社會的高度重視。尋求綠色、無污染、耐藥低的藥物已迫在眉睫。植物提取物作為新興抗菌藥物，既不會使細菌產生耐藥性也基本無殘留，將其制成防腐劑、化妝品、保健品和藥品具有良好的應用前景[16]。

本實驗中秦艽醇提物對不同細菌均有抑菌活性，對易于感染人體引起敗血癥和心內膜炎尿路、腹腔、盆腔感染、燒傷后傷口感染等疾病的糞腸球菌和敗血癥，慢性前列腺炎等疾病的表皮葡萄球菌均有較好的抑制作用。其抑菌作用大小順序為：65%乙醇提取物>無水乙醇提取物>水提取物。該結果為秦艽藥材的抗菌效用提供了實驗依據，為合理使用秦艽藥材奠定了基礎。endprint

由于不同提取溶劑極性不同，提取的各種成分有差異以及細菌自身生長所需環境要素及代謝方式的不同，不同溶劑提取物抑菌活性強弱也不盡相同[17]。在中藥提取物的抑菌實驗中，通常醇提物的藥理活性強于水提物，主要是由于不同濃度乙醇提取中藥成分能對化合物極性進行篩選，化學成分極性的差異導致藥理學作用效果不同[18]。本實驗結果與趙兵等[11]報道一致，秦艽藥材醇提部分的抑菌作用大于水提部分，說明其抑菌成分主要存在于醇提物中。秦艽主要成分是醇提物部分的環烯醚萜苷類，說明其與抗菌作用有一定關系，該研究也為下一步對其不同化學成分的抑菌能力考察提供參考依據。

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（收稿日期：2017-07-05 本文編輯：許俊琴）endprint