超聲協同靜電場提取黃花菜中總黃酮的研究

楊日福，耿琳琳，范曉丹

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超聲協同靜電場提取黃花菜中總黃酮的研究

楊日福1，耿琳琳1，范曉丹2

(1. 華南理工大學物理與光電學院，廣東廣州510640；2. 華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州510640)

在自發研究的提取裝置的基礎上，通過單因素試驗，比較超聲協同靜電場輔助提取和單獨使用超聲輔助提取黃花菜黃酮的提取效率；采用正交試驗，探索超聲協同靜電場輔助提取黃花菜總黃酮的最優工藝。結果表明：超聲協同靜電場提取比超聲輔助提取可以獲得更高的黃花菜黃酮提取得率；超聲協同靜電場的最佳提取因素組合是靜電場為7 kV，超聲電功率為600 W，乙醇體積濃度為50%，提取時間為40 min，固液比1:25以及提取溫度55℃由單因素試驗確定。在最佳因素的條件下，黃花菜黃酮的提取得率最高可達1.48%。通過探討超聲和靜電場的作用機理，從理論上解釋為超聲具有破壁作用，靜電場具有破膜作用。兩者結合共同作用時，靜電場可視為超聲場的一個隨機干擾，加強了超聲空化效應，強化了破壞植物細胞組織，獲得了更高的黃酮提取得率。

超聲；靜電場；協同；黃花菜；黃酮

0 引言

黃花菜(Hemerocallis citrina baroni)又名金針菜。在中國，黃花菜已有上千年的食用歷史，不僅味美而且還具有提高睡眠質量，緩解憂郁、安神醒腦、增智寬胸等藥用功效[1]。根據植物化學和藥理學的研究，黃花菜含有黃酮類、多酚類以及香精油等化學成分[2]。黃酮類化合物作為黃花菜的主要有效成分，具有延緩衰老、抗氧化以及清除自由基等多種保健功能，并且由于其毒副作用小、功能多等特點，其相關研究也日益受到重視[3-4]。超聲波在媒質中傳播時，會產生機械、熱和空化等系列效應，具有破壞植物細胞壁組織、增加細胞穿透性的功能，促使目標物質可以快速充分流出細胞外，在天然植物提取過程中發揮了重大作用[5]。與傳統方法相比，超聲提取(Ultrasound Extraction，UE)具有提取得率高、提取時間短、提取全過程無需高溫、節能環保等優點，因此超聲提取被廣泛應用于提取天然植物有效成分。但國內現有的超聲提取裝置中，功率強度受超聲探頭的數量所制約，無法破壞提取物料細胞膜，難以達到理想的提取效果。電場提取是一項近年來發展起來的新型高效分離技術，電場能使植物細胞膜產生電穿孔現象，提高了細胞膜傳質效率[6]。因此，超聲與電場協同提取能加速目標物質從細胞進入溶劑的過程，縮短提取時間，提高產品質量，減少能源消耗，獲得更高提取效率。史永剛[7]等人在脈沖電場降解苯酚的過程中加入超聲，結果發現：超聲與脈沖電場協同降解速率比單獨使用脈沖電場或單獨使用超聲有明顯提高，并且降解更徹底。謝閣[8]等人在提取啤酒酵母中核酸和蛋白質時，發現啤酒酵母先經過脈沖電場處理，再使用超聲提取，核酸與蛋白質提取率分別是單獨使用脈沖電場和超聲的1.5倍和2倍。

但目前關于超聲協同靜電場(Ultrasound combined with Electrostatic Field Extraction，UEFE)提取的研究不多，本研究組前期研制了超聲協同電場提取植物有效成分的裝置(正交耦合)，并利用該裝置進行了靜電場協同超聲提取甘草中甘草酸的研究，結果表明超聲與靜電場存在協同作用[9]。Sobotka[10]等進行直流電場對超聲信號的振幅影響研究表明：超聲-靜電場正交耦合不如平行耦合效果顯著。因此本文進一步研制出超聲-靜電場正交與平行同時耦合提取裝置，并應用于黃花菜中總黃酮的提取，探討協同效果和最佳提取工藝條件，為超聲協同靜電場提取技術應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 原 料

黃花菜由廣東銀新現代農業股份有限公司提供(自產自銷)；蘆丁標準品購于南京廣潤生物制品有限公司，純度大于99.9%；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇均為分析純。

1.2 主要儀器設備

SB-5DTD六邊型超聲波提取機是自行設計經寧波新芝生物科技股份有限公司加工而成，提取槽是六邊形柱體，其中六邊形的邊長為9.5 cm，提取槽高度為25 cm。每個側面安裝3個超聲換能器，側面換能器發出超聲場跟電場平行協同，底部由于面積有限，最大限度安裝了4個超聲換能器，底部換能器發出超聲場跟電場正交協同，超聲換能器頻率均為40 kHz，總超聲電功率400~1000 W連續可調。SC-15數控超級恒溫槽(寧波新芝生物科技股份有限公司)，恒溫水槽與超聲提取機相連，一是保證提取過程環境溫度恒定不變；二是方便進行提取溫度單因素試驗，確定試驗的最佳提取環境溫度。DE-100高壓電源(大連鼎通科技發展有限公司)，輸出直流電壓0~50 kV連續可調，自行搭建超聲協同靜電場提取裝置如圖1所示，提取槽中放入玻璃大試管，提取物料和溶劑放入試管中，試管蓋中央插入電極，中央電極由一根銅棒和絕緣材料保護套組成，與高壓電源的輸出正電壓相連，高壓電源的地端通過導線與超聲提取機的外殼相連。

1-六邊型超聲波提取機；2-換能器；3-不銹鋼金屬外殼； 4-提取物料和溶液；5-靜電場發生器；6-正電極；7-絕緣蓋； 8-玻璃容器；9-恒溫水入口；10-恒溫水；11-恒溫水出口； 12-六邊型超聲波提取機俯視圖

其余設備如下：101-0AB型電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；101AS-1型不銹鋼數顯電熱鼓風干燥箱(上海浦東榮豐科學儀器有限公司)；高速中藥粉粹機(武義縣屹立工具有限公司)；標準檢驗篩(浙江上虞市華豐五金儀器有限公司)；JJ500型精密電子天平(常熟雙杰測試儀器廠)；TDL-50B臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；UV-5200型紫外/可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；Freshmen單道可調式移液管(芬蘭Finnnpipette)。

1.3 方 法

1.3.1 標準曲線的繪制

準確稱取干燥至恒重的蘆丁20 mg置于50 mL的容量瓶中，用75%的乙醇溶解并定容，搖勻，得到0.4 mg/mL對照品溶液。精密吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL對照品溶液，分別置于25 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻后放置6 min；加10%硝酸鋁1.0 mL，搖勻放置6 min；加4%氫氧化鈉溶液10.0 mL，加75%乙醇定容，搖勻放置15 min，以相應試劑作空白對照，在波長510 nm處測吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，線性擬合得到標準曲線，曲線方程和相關系數如下：

其中，表示吸光度，單位為abs，表示濃度，單位為mg/mL。

1.3.2 黃花菜中總黃酮含量的測定

黃花菜干燥至恒重，粉碎，過60目篩。按照一定的液料比，取2 g物料與一定體積分數的乙醇混合置于大試管中。在設定的溫度、超聲電功率以及靜電場電壓下，提取一定的時間。提取結束后，將提取液在4 000 r/min轉速下進行離心10 min。取上清液并測量體積。進一步取上清液1 mL，按照1.3.1步驟，測定吸光度。通過標準曲線，得出1 mL提取液的黃花菜中總黃酮總質量，根據以下公式可以計算出總黃酮提取得率為

其中，是1 mL黃花菜提取液的總黃酮質量；是黃花菜提取液總體積；是黃花菜原料的重量2 g。

1.3.3 單因素對比試驗

1.3.3.1 靜電場電壓單因素試驗

取2 g黃花菜粉，按照液料比為1:20加入體積分數為70%的乙醇溶液40 mL。超聲電功率為600 W，靜電場電壓分別為3、7、10、13、16 kV，提取溫度為55℃，提取時間為30 min，分別考察靜電場電壓對黃花菜中總黃酮提取得率的影響。

1.3.3.2 乙醇體積分數單因素試驗

UE：取2 g黃花菜粉，液料比為1:20加入乙醇溶液40 mL，提取溫度為55℃，超聲電功率為600 W，提取時間為30 min，分別考察乙醇溶液體積分數為30%、40%、50%、60%、70%對黃花菜中總黃酮提取得率的影響。

UEFE：靜電場電壓為7 kV，其他條件同UE。

1.3.3.3 料液比單因素試驗

UE：取2g黃花菜粉，分別按照料液比為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30加入體積分數為60%的乙醇溶液20、30、40、50、60 mL。超聲電功率為600 W，靜電場電壓為7 kV，提取溫度為55℃，提取時間為30 min，分別考察料液比對黃花菜中總黃酮提取得率的影響。

UEFE：靜電壓電場為7kV，其他條件同UE。

1.3.3.4 提取時間單因素試驗

UE：取2g黃花菜粉，按照料液比為1:25加入體積分數為60%的乙醇溶液50 mL。超聲電功率為600 W，靜電壓為7 kV，提取溫度為55℃，分別提取10、20、30、40、50 min，考察提取時間對黃花菜中總黃酮的提取得率的影響。

UEFE：靜電場電壓為7 kV，其他條件同UE。

1.3.3.5 超聲電功率單因素試驗

UE：取2 g黃花菜粉，按照1:25的料液比加入體積分數為60%的乙醇溶液50 mL。分別采用超聲電功率400、500、600、700、800 W，靜電壓7 kV，提取溫度為55℃，提取時間為30 min，考察超聲電功率對黃花菜中總黃酮的提取得率的影響。

UEFE：靜電場電壓為7 kV，其他條件同UE。

1.3.3.6 提取溫度單因素試驗

UE：2 g黃花菜粉，分別按照1:25的料液比加入體積分數為60%的乙醇溶液50 mL。采用的超聲電功率為700 W，靜電壓為7 kV，提取溫度分別為45℃、55℃、65℃、75℃、85℃，提取時間為30 min，考察提取溫度對黃花菜中總黃酮提取得率的影響。

UEFE：靜電場電壓為7 kV，其他條件同UE。

1.3.4 UEFE工藝優化

根據單因素試驗，確定料液比為1:25，提取溫度55℃為最優化條件，其余靜電場電壓、超聲電功率、溶液中乙醇體積分數和提取時間等因素，進行4因素3水平正交試驗，設計表見表1。

表1 正交試驗設計表(4因素3水平)

2 實驗結果與討論

2.1 靜電場電壓對黃花菜中總黃酮提取得率的影響

靜電場電壓對黃花菜中總黃酮提取得率的影響如圖2所示，從圖2可以看出：在靜電場作用下，總黃酮提取得率隨靜電場電壓先上升后下降，7 kV時達到最大值1.45%，主要原因是靜電場電壓對植物細胞組織細胞膜有一定的破壞作用。隨著靜電場的增強，細胞膜組織破壞程度加深，目標物質流出增加，從而總黃酮提取得率提高。當電場強度過大時，目標分子結構會被破壞，黃酮提取得率降低。

圖2 靜電場電壓對黃花菜中總黃酮提取得率的影響

Fig 2 Effect of electrostatic field on extraction yield of H.flavonoids

2.2 體積分數對黃花菜中總黃酮提取得率的影響

乙醇體積分數對黃花菜中總黃酮提取得率的影響如圖3所示，從圖3可以看出：UEFE與UE兩種提取方法下的黃酮提取得率有相同的變化趨勢，即先迅速升高之后略有降低，原因是黃花菜中含有的黃酮類化合物難溶于水易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑，所以當乙醇分數體積增加時，增加了黃酮類化合物的溶解性，從而提高了黃花菜總黃酮的提取得率，在乙醇體積分數增加到一定程度時，一方面是更高的乙醇濃度會使離子強度降低，影響細胞膜氣孔的形成，導致細胞膜滲透過程減慢，從而影響了黃花菜中總黃酮的提取得率降低。另一方面是由于乙醇體積分數過高，導致在提取的過程揮發嚴重，同時一些醇溶性雜質、色素、脂溶性強的成分溶出量增加，與黃酮類化合物競爭并與乙醇結合，因而導致提取得率略有下降。因此最佳的乙醇體積分數為60%。同時從圖中也可以看出黃酮提取得率UEFE法始終比UE法高，說明靜電場對黃花菜中總黃酮的提取有促進作用。

2.3 液料比對黃花菜中總黃酮提取得率的影響

料液比對黃花菜中總黃酮提取得率的影響如圖4所示，從圖4可以看出：液料比為10 mL/g時，UEFE法與UE法的黃花菜中總黃酮的提取得率基本相同，隨著液料比的增加，UEFE與UE法的黃花菜中總黃酮的提取得率迅速拉開差距，最終兩種方法的提取得率差距趨于穩定，即UEFE相對于UE方法，黃花菜中總黃酮的提取得率更高，再次證明靜電場對黃花菜中總黃酮的提取得率有促進作用。總的來說，UEFE與UE法的變化趨勢一致，黃酮提取得率先隨著液料比的增加而增加，之后隨著液料比的繼續增加會有降低。這主要是因為液料比增大時，細胞內與細胞外目標物質濃度差別較大，也就是說增加了物質推動力，從而使得黃花菜中總黃酮提取得率增加，但是當料液比達到25 mL/g之后，因為溶劑量過大，會使得超聲和靜電場難于作用于物料，使得目標物質流出速度減慢，因而提取得率有所下降。

圖3 乙醇體積分數對黃花菜中總黃酮提取得率的影響

圖4 液料比對黃花菜中總黃酮提取得率的影響

2.4 提取時間對黃花菜中黃酮提取得率的影響

提取時間對黃花菜中總黃酮提取得率的影響如圖5所示，從圖5可以看出：對于UEFE和UE方法來說，在30 min時提取得率均達到了最大。總的趨勢都是先隨著提取時間的增加而增加，隨后隨著提取時間的增加會持續下降。這主要是因為時間過短，目標物質黃酮類化合物沒有完全析出，所以隨著提取時間的增加，使得黃酮類化合物的析出逐漸增加直至達到一種平衡狀態。當提取時間再繼續增加時，由于超聲與靜電場的長時間作用導致提取出的有效成分的結構遭到破壞，因此黃酮的提取得率有所下降。

圖5 提取時間對黃花菜中總黃酮提取得率的影響

2.5 超聲電功率對黃花菜中總黃酮提取得率的影響

超聲電功率對黃花菜中黃酮提取得率的影響如圖6所示，從圖6可以看出：UEFE和UE具有相同的趨勢，即在一定的范圍內黃花菜中總黃酮提取得率隨著超聲電功率的增加而提高，在超聲電功率達到700 W時，黃花菜中總黃酮提取得率達到最大。之后隨著超聲功率的繼續增加，黃花菜中總黃酮的提取得率有所下降。原因是對于一定頻率和一定發射面的超聲來說，聲強隨著功率的增大而增大。而聲強增大，聲壓幅值以及液體中的壓力也增大，空化泡崩潰所需的時間將變短，也就是說單位時間內超聲產生的空化效應越大，從而有利于黃花菜中總黃酮提取得率的提高。在超聲電功率達到700 W之后，黃酮的提取得率有所下降，這是因為聲強的增大，聲壓幅值增加(聲壓與聲強的幅值的平方成正比)，空化泡在聲波膨脹相內可能增加到很大，以至于它在聲波的壓縮相內還來不及發生崩潰；此外，太高的聲強產生的的大量空化泡通過反射而減少了能量的傳遞，并且與聲強的增加呈非線性關系，因而不利于提取。所以選擇700 W是最佳的提取條件。

圖6 超聲電功率對黃花菜中總黃酮提取得率的影響

2.6 提取溫度對黃花菜中總黃酮提取的影響

提取溫度對黃花菜中總黃酮提取得率的影響如圖7所示，從圖7可以看出：UEFE和UE兩種方法下的黃花菜黃酮提取得率在溫度因素的變化下，都有相同的變化趨勢，在55℃時得到了最大的黃酮提取得率，即都是先隨著溫度的上升而上升，之后隨著溫度的下降而下降。可能是由于溫度升高使得溶液中分子運動更加激烈，一方面可能使得黃酮的溶解力增強，另一方面會使得目標物質黃酮從細胞內向細胞外轉移的速度加快，從而使得黃酮提取得率提高。但是溫度過高，會使得乙醇揮發嚴重，黃酮分子結構也可能遭到破壞，因此黃酮的提取率下降。綜合考慮，溫度在55℃是最佳的提取條件。

圖7 提取溫度對黃花菜中總黃酮提取得率影響

2.7 正交試驗討論

從表2所示正交實驗結果可以看出，各個因素對黃花菜黃酮提取得率的影響力不同，根據極差分析，其影響主次順序為：超聲電功率>乙醇體積分數>靜電場>提取時間。由表2中的數據可以看出，最大的黃花菜中總黃酮提取得率是1.48%，其對應的組合為A1B2C1D3。即優化后的試驗條件為：靜電場為7 kV，超聲電功率為600 W，乙醇體積分數為50%，提取時間為40 min。

2.8 機理討論

表2 正交試驗結果表

3 結論

在自主研究的提取裝置的基礎上，單因素試驗確定了超聲協同靜電場提取黃花菜中總黃酮的最佳提取溫度為55℃和最佳料液比為1:25，進一步的正交試驗得出其他最佳工藝條件，即靜電場為10 kV，超聲電功率為600 W，乙醇體積分數為70%，提取時間為20 min。在最佳條件組合下，黃花菜中總黃酮的提取得率達到了1.47%。通過UE和UEFE兩種提取方法單因素試驗對比可以看出，在相同的條件下，UEFE方法下的黃花菜中總黃酮提取得率始終要比UE方法高，說明加入靜電場對黃花菜中總黃酮的提取得率有促進作用。從理論上可以知道，對于超聲提取，空化效應占主導地位。對于超聲而言，靜電場相當于給超聲提取增加了微干擾，微干擾的加入會加強超聲空化效應，從而強化了對細胞組織的破壞，提高了黃花菜總黃酮的提取得率。

[1] Gu L, Liu Y J, Wang Y B, et al. Role for monoaminergic systems in the antidepressant-like effect of ethanol extracts from Hemerocalliscitrina.[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2012, 139(3): 780- 787.

[2] Yi L T, Jing L, Li H C, et al. Ethanol extracts from Hemerocalliscitrina attenuate the decreases of brain-derived neurotrophic factor, TrkB levels in rat induced by corticosterone administration[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2012, 144(2): 328-334.

[3] Amado N G, Fonseca B F, Cerqueira D M, et al. Flavonoids: Potential Wnt/beta-catenin signaling modulators in cancer[J]. Life Sciences, 2011, 89(s1516): 545-554.

[4] Routray W, Orsat V. Microwave- extraction of flavonoids: A review[J]. Food & Bioprocess Technology, 2011, 5(2): 409-424.

[5] Tom?ik A, Pavli? B, Vladi? J, et al. Optimization of ultrasound- extraction of bioactive compounds from wild garlic (Allium ursinum L.)[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2016, 29(3): 502-511.

[6] Puértolas E, Mara?ón I M D. Olive oil pilot-production by pulsed electric field: impact on extraction yield, chemical parameters and sensory properties[J]. Food Chemistry, 2015, 167(1): 497-502.

[7] 史永剛, 土明林, 王帥. 一種超聲協同脈沖電場處理含酚廢水的降解法: 中國, CN201210300174A[P]. 2012-11-14.

SHI Yonggang, TU Minglin, WANG Shuai. A method for degradation of ultrasound combined with pulsed electric field processing phenol wastewater: China, CN201210300174A [P]. 2012-11-14.

[8] 謝閣, 楊瑞金, 盧蓉蓉, 等. 高壓脈沖電場和超聲波協同作用破碎啤酒廢酵母的研究[J]. 食品科學, 2008, 29(7):133-137.

XIE Ge, YANG Ruijin, LU Rongrong, et al. Combined high pulsed electric field and ultrasounddisruption of cell of beer yeast[J]. Food science, 2008, 29(7): 133-137.

[9] 楊日福, 閔志玲, 陳維楚, 等. 靜電場協同超聲提取甘草中甘草酸的研究[J]. 應用聲學, 2014, 33(2): 160-166.

YANG Rifu, MIN Zhiling, CHEN Weichu. Eletrostatic fields combined with ultrasound extraction of glycyrrhizic acid from glycyrrhiza[J]. Applied acoustics, 2014, 33(2): 160-166.

[10] Sobotka J. Longitudinal ultrasonic waves in DC electric field[J]. Acta Geophysica, 2009, 57(2): 247-256.

[11] 趙超. 超聲強化亞臨界水提取枸杞多糖的研究[D]. 廣州: 華南理工大學, 2014.

ZHAO Chao. Subcritical water enhanced ultrasound extraction of polysaccharides from wolfberry[D]. Guangzhou: South China University of Science and Techonogy, 2014.

[12] 劉錚. 高壓脈沖電場及超聲場提取啤酒廢酵母中蛋白質與核酸[D]. 無錫: 江南大學, 2007.

LIU Zheng. Combined high pulsed electric field and ultrasound extraction of protein and nucleic acidfrom beer yeast[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2007.

[13] 劉巖. 增強超聲空化效應的一個途徑---給空化聲場一個隨機微擾[J]. 應用聲學, 1997, 16(2): 43-45.

LIU Yan. A way of enhancing ultrasonic cavitation effect-a random perturbation for cavitation field[J]. Applied acoustics, 1997, 16(2): 43-45.

[14] 陳維楚. 超聲協同靜電場強化提取過程機理研究[D]. 廣州: 華南理工大學, 2012.

CHEN Weichu. The mechanismsofultrasoundcombined with high pulsed electric field extraction[D]. Guangzhou: South China University of Science and Techonogy, 2012.

Research on ultrasound combining electrostatic field extraction of favonoids from hemerocallis citrine baroni

YANG Ri-fu1, GENG Lin-lin1, FAN Xiao-dan2

(1. School of Physics and Optoelectronics, South China University of Technology, Guangzhou 510640, Guangdong, China; 2. College of Light Industry and Food Sciences, SouthChinaUniversity of Technology, Guangzhou 510640, Guangdong, China)

The ultrasound combining electrostatic field extraction offlavonoids from hemerocallis citrine baroni (H.flavonoids) is investigated by orthogonal experiments. Results show that the combining extraction is very effective compared to only ultrasound extraction, allowing higher extraction yields under the same single-factor conditions. The optimum conditions for the ultrasound combining electrostatic fieldextraction are as follows: electrostatic fieldof 10kV, ultrasonic power of 600W, ethanol concentration of 50%, extraction time of 40 min. The liquid/solid ratio of 25/1(ml/g) and extraction temperature of 55℃are determined by single factor experiments. Under the optimum conditions, the extraction yield of H.flavonoids is 1.48%. The mechanisms of ultrasound extraction and electrostatic fieldextraction are respectively destroying cell wall and breaking cell membrane. Moreover, electrostatic field can be regarded as a random disturbance for ultrasonic field, which strengthens the ultrasonic cavitation effect, strengthens the destruction of plant cells and gains higher flavonoids extraction rate.

ultrasound; electrostatics fields; synergy; hemerocallis citrine baroni; flavonoids

TQ028.9+6

A

1000-3630(2017)-01-0032-06

10.16300/j.cnki.1000-3630.2017.01.007

2016-03-28;

2016-06-29

國家自然科學基金項目(11464002); 廣東省省部產學研結合項目(2013B090600034); 中央高校基本科研業務費專項資金(x2qsD2154180); 國家自然科學基金青年基金項目(21406074); 廣東省科技計劃項目(2013B020311006和2014A020208017)

楊日福(1969－), 男, 廣東吳川人, 博士, 教授, 研究方向為超聲化工研究。

范曉丹, E-mail: fanxd@scut.edu.cn