條件培養基對氧—葡萄糖剝奪誘導皮層神經元死亡的保護作用

張鵬 張鵬飛 高琛

【摘要】 目的 研究臍帶間充質干細胞源條件培養基（CM）對氧-葡萄糖剝奪（OGD）誘導皮層神經元死亡的保護作用。方法 培養 10 d的皮層神經元更換培養基為 EBSS平衡鹽溶液， 后置于37℃低氧（N2∶CO2∶O2=94%∶5%∶1%）培養箱內孵育， 4 h后恢復正常條件培養， 同時更換為條件培養基作用20 h，

用Hoechst33342 / PI 的染色方法檢測其死亡情況。結果 原代培養的 UCMSCs 傳至第三代時， 細胞形態為長梭形的纖維狀， 折光性好;在培養的皮層神經元建立OGD模型， Control組細胞死亡率為（5.85%±0.41）%， OGD組細胞死亡率（35.6%±1.75）%， Control組與OGD組比較差異有統計學意義（P<0.01）， OGD模型建立成功;復氧0 h時給予臍帶間充質干細胞源條件培養基， 作用24 h后， OGD+CM組細胞死亡率為（27.98±2.19）%， OGD+CM組與OGD組比較差異有統計學意義（P<0.05）， CM可使皮層神經元的死亡率降低21.40%。結論 臍帶間充質干細胞源條件培養基對氧-葡萄糖剝奪誘導皮層神經元具有保護作用。

【關鍵詞】 氧-葡萄糖剝奪模型;間充質干細胞;條件培養基;皮層神經元

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.12.120

缺血性腦卒中是因各種原因導致大腦供血不足， 從而引起腦組織壞死的總稱， 具有發病率高、致死率高和致殘率高的特點。氧-葡萄糖剝奪（Oxygen-Glucose Deprivation， OGD）模型是最常用的缺血性腦卒中的體外模型， 能夠在體外很好的模擬腦卒中的病理狀態。

臍帶間充質干細胞（Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells， UCMSCs）來源于中胚層間充質的成體干細胞， 具有易于獲取， 無倫理學爭議， 增殖能力較強， 易于體內外擴增等特性， 成為臨床干細胞移植的重點關注對象， 然而無論通過何種途徑輸入體內， 到達靶器官的細胞數量、狀態及存活時間尚無足夠的研究證實， 而間充質干細胞在培養過程中發現其可通過旁分泌途徑分泌血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、 成纖維細胞生長因子（Basic Fibroblast Growth Factor， bFGF）等大量生物活性物質[1， 2]， 近年亦有研究報道間充質干細胞（mesenchymal stem cell， MSCs）衍生的胞外囊泡可參與細胞間傳遞、細胞內信號傳導以及在體內短距離或長距離運輸以改變細胞或組織的代謝[3]， 因此， 嘗試使用臍帶間充質干細胞來源的條件培養基（Condition Medium， CM）進行研究， 觀察其保護神經元的作用。

目前應用細胞模型研究條件培養基保護OGD中神經元死亡的相關研究較少， 本實驗制備臍帶間充質干細胞來源條件培養基， 其中含有臍帶間充質干細胞分泌的大量細胞因子成份， 在體外細胞培養模型中研究其對神經元的保護作用， 從而為缺血性腦血管病的臨床治療提供新的思路和實驗依據?，F報告如下。

1 材料與方法

1. 1 臍帶間充質干細胞的原代培養與條件培養基的獲取

UCMSCs的原代分離培養：將無菌條件下獲取的臍帶組織用無菌磷酸緩沖液（PBS）沖洗多次， 至無血跡殘留;仔細剔除臍帶內血管與表面組織;將組織剪碎， 加入Ⅳ型膠原酶，

37℃消化17～20 h， 期間不時搖晃;再用40 ?m篩網過濾， 去除較大組織塊;2000 r/min， 離心5 min， 棄去上清， 將沉淀用無菌PBS清洗2～3次;1000 r/min， 離心5 min， 接種。用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養基重懸離心管中的細胞， 鏡下細胞計數， 使細胞密度達到1×106個/ml， CO2培養箱培養， 換液， 將臍帶間充質干細胞不斷傳代、純化， 得到UCMSCs。

UCMSC-CM的收集：純化后的UCMSCs， 收集每次換液的培養基， 經1500 r/min離心去除細胞碎片后， 放置在-80℃冰箱保存。

1. 2 Elisa檢測條件培養基中細胞因子 向96孔板加入100 μl 1×稀釋液， 作為陰性對照。同時加入所測因子的標準品100 μl到96孔板， 然后將所測樣品100 μl加到96孔板， 每個樣品2個微孔， 室溫下避光孵育2 h。孵育結束后向每個微孔加入200 μl酶標檢測抗體， 室溫下孵育2 h。然后用400 μl l×沖洗液洗滌， 最后加入200 μl顯色底物（顯色劑A和顯色劑B各100 μl）， 室溫下孵育30 min， 然后加入50 μl終止液， 用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值）， 通過標準曲線計算樣品中生長因子的含量。計算神經營養因子（BDNF）、胰島素樣生長因子-I（IGF-1）、VEGF、bFGF、轉化生長因子-β（TGF-β）、肝細胞生長因子（HGF）、白細胞介素-6（IL-6）的濃度。每個樣品重復4次， 每組取3個樣品。

1. 3 OGD的構建 取培養至10 d的皮層神經元， 用無糖EBSS漂洗 1 次， 將細胞培養基置換為無糖EBSS， 原培養液留至復氧后繼續使用。于缺氧孵箱（ 94% N2， 1% O2， 5% CO2， 37℃）缺氧 4 h后更換為正常培養基復氧， 繼續培養20 h進行檢測。

1. 4 皮層神經元死亡的檢測 向OGD成功后的皮層神經元培養液內直接加入 Hoechst33342（sigma， 10 μg/ml）， 37℃作用 10 min， 再加入PI（sigma， 5 μg/ml） 37℃作用5 min ， 在熒光顯微鏡下觀察細胞死亡情況并拍照計數。Hoechst33342 標記活細胞及凋亡早期的細胞， PI標記的為壞死細胞及凋亡晚期細胞， 細胞死亡率= PI 陽性細胞數/總細胞數×100%。

1. 5 統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗;計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 原代培養的UCMSC-CM中細胞因子含量的檢測結果

原代培養的UCMSCs 傳至第三代時， 細胞形態為長梭形的纖維狀， 折光性好。見圖1。用Elisa法測定CM內多種細胞因子BDNF、IGF-1、VEGF、bFGF、TGF-β、HGF、IL-6的含量。見表1。從檢測結果來看， CM中含豐富的BDNF

（220.68±16.80）pg/ml、IGF-1（14.71±1.12）pg/ml、bFGF（16.27±2.89）pg/ml、VEGF（68.53±1.85）pg/ml、TGF-β（73.56±5.59）pg/ml、HGF（116.05±3.32）pg/ml、IL-6（89.48±6.27）pg/ml等多種細胞因子。

2. 2 條件培養基對OGD的皮層神經元死亡的影響 在培養的皮層神經元建立OGD 模型。見圖2。Control組細胞死亡率為（5.85±0.41）%， OGD 組細胞死亡率為（35.6±1.75）%。Control組與OGD組比較差異有統計學意義（P<0.01）， OGD模型建立成功。復氧0 h時給予臍帶間充質干細胞源條件培養基， 作用24 h后， 與OGD組進行比較， OGD+CM組細胞死亡率為（27.98±2.19）%， OGD+CM組與 OGD組比較差異有統計學意義（P<0.05）， CM可使皮層神經元的死亡率降低21.40%。

3 討論

隨著缺血性腦卒中發病率越來越高， 給人類健康帶來了嚴重威脅， 迫切需要新的有效治療手段的出現。間充質干細胞由于其體外易于獲取， 無倫理學爭議， 增殖能力較強， 易于體內外擴增等特性， 常被用于細胞移植的臨床試驗， 目前可從www.clinicaltrials.gov網站上查詢到的使用間充質干細胞的臨床試驗有600余例。大量動物實驗表明， 間充質干細胞可用于治療基于動物模型的多種疾病， 并具有很好的安全性， 間充質干細胞通過釋放多種細胞因子促進內源性神經、血管的再生， 促進突觸聯系、髓鞘的再生， 并可抑制細胞凋亡， 調節炎癥反應[4-6]。既往對間充質干細胞的研究側重于細胞的分化替代功能， 很少關注其旁分泌現象， 本實驗選用間充質干細胞源的條件培養基作用于OGD模型中的皮層神經元， 觀察其對神經元的保護作用， 以此證實條件培養基對缺血性腦卒中的治療作用， 具有一定的創新性。

大量研究報道間充質源條件培養基對疾病模型具有與MSC類似的作用， Markovic等[7]認為MSC-CM通過抑制免疫細胞的介入從而減輕順鉑誘導的腎毒性;Shen等[8]通過大量體內外實驗研究， 表明UCMSC可分泌多種可溶性的細胞因子與趨化因子至CM中， 增強CXCR4或CCR2陽性細胞的遷移與血管形成能力;Li等[9]認為MSC-CM可明顯改善角質形成細胞的增殖與遷移能力。缺血性腦卒中發生時， 由于血供突然中斷， 氧氣、葡萄糖供給急劇下降， 使該部位腦組織崩解破壞， 興奮性氨基酸大量釋放， 神經元內鈣超載， 導致神經元損傷;同時， 自由基的大量產生以及與凋亡相關基因的表達和炎癥反應的發生， 進一步加劇神經元的損傷[10-13]。

本研究中， 運用預存的神經元培養液和適量的新鮮培養液為神經元復氧， 谷氨酸大量產生， 給予間充質干細胞源的CM后， 細胞死亡率明顯下降， 表明CM對OGD模型中的皮層神經元具有顯著的保護作用， 而CM中經檢測含有大量的活性細胞因子， 提示CM可能通過多種活性因子的作用減輕神經元在缺血缺氧性環境中受到一系列損傷[14， 15]。當然， 其具體的作用機制仍須進一步的實驗進行驗證。

綜上所述， 臍帶間充質干細胞源條件培養基對OGD模型中的皮層神經元具有顯著的保護作用， 這可能與CM 中含有多種細胞活性因子發揮保護作用有關。

參考文獻

[1] 陳峰， 劉斌， 明圓圓， 等. 靜脈注射骨髓間充質干細胞條件培養基治療腦缺血再灌注損傷. 中國組織工程研究， 2015， 19（28）： 4544-4548.

[2] 楊昆， 申才良， 宋旆文， 等. 條件培養基對神經干細胞增殖與分化作用的影響. 安徽醫科大學學報， 2015（6）：735-739.

[3] Phinney DG， Pittenger MF. Concise Review： MSC-Derived Exosomes for Cell-Free Therapy. Stem Cells， 2017， 35（4）：851.

[4] Hu X， Zhang M， Leak RK， et al. Delivery of neurotherapeutics across the blood brain barrier in stroke. Current Pharmaceutical Design， 2012， 18（25）：56-57.

[5] 趙慶杰， 劉玉梅， 宋冬晶， 等. γ-羥基丁酸對神經細胞缺氧復氧損傷的保護作用與γ-氨基丁酸及其A受體的關系. 中風與神經疾病， 2005， 22（5）：416-418.

[6] 李樹基. BK通道在氧葡萄糖剝奪誘導海馬神經元死亡中的作用. 南方醫科大學， 2009.

[7] Markovic BS， Gazdic M， Arsenijevic A， et al. Mesenchymal Stem Cells Attenuate Cisplatin-Induced Nephrotoxicity in iNOS-Dependent Manner. Stem Cells International， 2017， 2017（10）：1-15.

[8] Shen C， Lie P， Miao T， et al. Conditioned medium from umbilical cord mesenchymal stem cells induces migration and angiogenesis. Molecular Medicine Reports， 2015， 12（1）：20.

[9] Li M， Zhao Y， Hao H， et al. Mesenchymal stem cell-conditioned medium improves the proliferation and migration of keratinocytes in a diabetes-like microenvironment. International Journal of Lower Extremity Wounds， 2015， 14（1）：73.

[10] Vand LY， Chatagner A， Quairiaux C， et al. Multi-modal assessment of long-term erythropoietin treatment after neonatal hypoxic-ischemic injury in rat brain. Plos One， 2014， 9（4）：e95643.

[11] Lan KM， Lu-Tai T， Cai Z， et al. Erythropoietin Ameliorates Neonatal Hypoxia-Ischemia-Induced Neurobehavioral Deficits， Neuroinflammation， and Hippocampal Injury in the Juvenile Rat. International Journal of Molecular Sciences， 2016， 17（3）：289.

[12] 趙珅婷. BNIP3-AIF/Endo G通路介導氧葡萄糖剝奪誘導的海馬神經元死亡. 南方醫科大學， 2009.

[13] 劉偉， 江山， 劉毅， 等. 氧氣葡萄糖剝奪誘導原代培養的星形膠質細胞釋放谷氨酸. 細胞與分子免疫學雜志， 2014， 30（6）： 569-572.

[14] 谷淑玲， 李梅， 崔家勇， 等. 羥丁酸鈉對大鼠原代培養皮層神經元缺氧復氧損傷的保護作用與GABA_A受體的關系. 中國臨床藥理學與治療學， 2002， 7（5）：385-388.

[15] 李超. GABA保護氧糖剝奪和谷氨酸對海馬神經元的損傷. 哈爾濱醫科大學， 2009.

[收稿日期：2017-12-29]