烤煙存儲期間煙葉酶活性變化的初步研究

王川 劉紫薇 朱啟法 張麗娜 馬稱心 張朝 高琴 陳學平

摘要 [目的]探究初烤煙存儲過程中煙葉相關酶活性變化。[方法]以烤煙品種 NC89 為材料，研究皖南地區煙葉存儲過程中多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、脂氧合酶（LOX）、苯丙氨酸裂解酶（PAL）活性隨存儲時間延長的變化趨勢。[結果]隨著存儲時間變長，幾種酶活性均呈現先上升后下降的趨勢。其中多酚氧化酶、脂氧合酶和苯丙氨酸裂解酶活性在存儲180 d時分別達到最大值[50.50 U/g，34.20、0.54△OD/（g·min）]，而過氧化物酶活性則在存儲270 d時達到最大值（118.90 U/g）。[結論]該研究為進一步豐富煙葉陳化理論，探究烤煙存儲質量提升形成機理提供了參考。

關鍵詞 烤煙；存儲；酶活性

中圖分類號 TS41+1文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）15-0001-02

Abstract [Objective]To explore the activity changes of related enzymes in flue-cured tobacco leaves during storage. [Method]We studied the activity change trends of polyphenol oxidase （PPO）， peroxidase （POD）， lipoxygenase （LOX） and phenylalanine lyase （PAL） in tobacco leases with the extension of storage time based on NC89 flue-cured tobacco as experimental material in south Anhui. [Result]As the storage time increased， the activity of four enzymes showed a tendency of increasing first and then decreasing. The maximum activity of polyphenol oxidase， lipoxygenase and phenylalanine were reached when the tobacco were stored 180 days. The maximum were 50.50 U/g， 34.20， 0.54 △OD/（g·min）， respectively， while the peroxidase activity reached the maximum（118.90 U/g） when the tobacco were stored 270 days.[Conclusion]The study provides a reference for further enriching the theory of tobacco leaf aging and exploring the mechanism of improving the quality of flue-cured tobacco during storage.

Key words Flue-cured tobacco；Storage；Enzyme activity

煙葉陳化能夠改善煙葉的香味品質，是提高煙葉可用性的重要環節[1]。在煙葉存儲期間，煙葉內各種化學變化借助自然氣候的變化加速進行，從而改善煙葉品質和理化性狀，這一過程被稱為自然陳化。酶類是陳化過程中提高煙葉發酵質量的動力，是煙葉陳化的主要機理之一[2]。烤煙存儲過程中，在酶類的作用下烤煙煙葉中的多種物質氧化分解形成重要的香氣成分，多酚氧化酶、過氧化物酶、脂氧合酶和苯丙氨酸裂解酶則是其中主要的酶類，對促進煙葉陳化發酵、提高煙葉品質具有積極作用。前人[3-6]對初烤煙存儲期間相關酶的活性變化進行了大量的研究。為了進一步豐富煙葉陳化理論、探究烤煙存儲質量提升形成機理，筆者以皖南地區存儲烤煙為材料，研究了烤煙在陳化過程中多酚氧化酶、過氧化物酶、脂氧合酶、苯丙氨酸裂解酶活性的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

以烤煙品種NC89初烤煙為材料，烘烤后于自然條件下儲存。每隔45 d取1次樣，煙葉去主脈，干燥、粉碎后備用。

1.2 方法

1.2.1 多酚氧化酶活性測定。參照朱廣廉等[7]的方法：取1 g樣品，加入預冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.8）1 mL，研磨，再加1 mL緩沖液，傾入5 mL離心管，于4 ℃、10 000 r/min離心20 min，收集上清液。反應體系為3 mL 0.2 mol/L鄰苯二酚（用pH 7.8磷酸緩沖液配制），1 mL酶液，以滅活酶液作為空白對照，于30 ℃下水浴10 min，立即用20%三氯乙酸中止反應。5 000 r/min離心10 min后，取上清液于495 nm處測定其吸光值。

1.2.2 過氧化物酶活性測定。參照李玲等[8]的方法：取1 g樣品，加入0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.0），在冰浴中研磨，12 000 r/min離心20 min，收集上清液。4.7 mL反應液包括2.7 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 5.5），1.0 mL 2%的H2O2，1.0 mL 0.05 mmol/L愈創木酚。向反應液中加入0.3 mL 酶液（空白管為0.3 mL pH 7.0的磷酸緩沖液）混勻后，水浴 37 ℃反應15 min，冷卻后測定其在470 nm處的吸光值。

1.2.3 脂氧合酶活性測定。參照宮長榮等[9]的方法：取0.5 g樣品，加入0.10 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）在冰浴中研磨，12 000 r/min離心20 min，收集上清液。取0.3 mL酶液于試管中，加入2 mL底物乳狀液（2.24 mmol/L亞油酸分散于含0.5 μL/mL吐溫-20的0.1 mol/L、pH 9.0的硼酸緩沖液中），混勻后放入30 ℃水浴中并開始計時，反應3 min后加入5 mL無水乙醇終止反應，然后加入5 mL蒸餾水混勻并測定其在234 nm處的吸光值。

1.2.4 苯丙氨酸裂解酶測定。參考張志良等[10]的方法：取1 g樣品，加入0.10 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）在冰浴中研磨，12 000 r/min離心20 min，收集上清液。1 mL酶液中加1 mL 0.02 mol/L苯丙氨酸，2 mL蒸餾水，總體積為4 mL。空白管不加底物，多加1 mL蒸餾水。反應液于30 ℃水浴中反應30 min，反應結束后于290 nm處測定吸光值。

2 結果與分析

2.1 存儲期間多酚氧化酶和過氧化物酶活性分析

由圖1可知，存儲初期多酚氧化酶活性呈現逐漸升高的趨勢，存儲0～90 d時上升較緩，90～180 d過程中酶活性迅速升高，在180 d時酶活性達到最大值 （50.50 U/g），此時是存儲初期多酚氧化酶活性的5.55倍；之后隨存儲時間延長酶活性迅速降低，至270 d時趨于平穩；存儲360 d時，煙葉中多酚氧化酶活性降低到5.48 U/g。

由圖2可知，烤煙煙葉過氧化物酶活性在存儲初期迅速上升，至180 d后上升趨勢變緩，存儲270 d時過氧化物酶活性達到最大值（118.90 U/g），此時是存儲初期酶活性的17.49倍；之后隨存儲時間延長酶活性迅速下降，至存儲360 d時酶活性降低到34.50 U/g，此時過氧化物酶活性仍顯著高于存儲初期，是存儲初期過氧化物酶活性的5.07倍。

2.2 存儲期間脂氧合酶和苯丙氨酸裂解酶活性分析

由圖3可知，在烤煙存儲過程中，隨著時間的延長，烤煙煙葉中脂氧合酶活性變化與多酚氧化酶呈現的先升高后降低的變化趨勢基本一致。存儲初期脂氧合酶活性不斷升高，到180 d時達最高值[34.20△OD/（g·min）]，較存儲初期脂氧合酶活性增加了72.55%。而后脂氧合酶活性逐漸下降，存儲180～225 d酶活性下降較快，之后下降變緩；存儲360 d時脂氧合酶活性為24.10△OD/（g·min）。

由圖4可知，存儲初期苯丙氨酸裂解酶活性為0.31△OD/（g·min），之后隨存儲時間延長酶活性持續升高，至存儲180 d時達最大值[0.54△OD/（g·min）]，酶活性較存儲初期增加了74.19%。之后隨時間延長酶活性緩慢下降，至存儲315 d后趨于平穩。存儲360 d時，苯丙氨酸裂解酶達0.44△OD/（g·min），仍顯著高于存儲初期。

3 結論與討論

對皖南地區烤煙煙葉中酶活性的測定結果表明，在存儲期間，煙葉中的多酚氧化酶、過氧化物酶、脂氧合酶及苯丙氨酸裂解酶一直具有一定活性，并且具有相似的變化規律：存儲初期，4種酶活性均隨時間延長而逐漸上升，至存儲180 d或270 d后達到最大值，隨后酶活性逐漸下降。這與趙銘欽等[11-12]、韓錦峰等[13]的研究結果一致。

在多酚氧化酶和過氧化物酶的共同作用下，烤煙煙葉中的多酚類物質可被氧化成為醌類物質，醌類物質又與氨基酸、蛋白質及其他化合物縮合成大分子物質，形成香氣物質的前體物，并賦予煙草制品優雅的香氣、改善余味、增加香氣量，對提高烤煙煙葉的品質具有良好作用[14-15]。脂氧合酶是脂類物質氧化降解代謝過程中的重要酶。類胡蘿卜素在脂氧合酶的作用下可以氧化分解成中間產物香葉醇、紫羅蘭酮、紫黃質、黃質醛等，是烤煙煙葉中的重要致香物質[16]。苯丙氨酸裂解酶主要參與煙葉中苯丙氨酸的代謝，烤煙煙葉中許多重要揮發性香氣成分如苯甲醇、苯乙醇等的形成均與其代謝密切相關[17]?？緹煙熑~中多酚氧化酶、過氧化物酶、脂氧合酶和苯丙氨酸裂解酶的酶活性在存儲期間的動態變化很可能與煙葉表面微生物的活性變化有關。煙葉陳化過程是一個經過烘烤之后不存在生命活性的干物體自然發酵過程。煙葉自身存在的酶在初烤階段幾乎全部高溫鈍化失活，煙葉自身的細胞結構也遭到破壞。而隨著存儲時間的延長，酶活性逐漸增加則可能與烤煙煙葉表面的微生物活動有關。烤煙煙葉表面微生物分泌酶從而導致烤煙煙葉的酶活性發生變化，因此煙葉表面的微生物分泌物可能加速烤煙陳化，促進陳化的進行從而改善烤煙煙葉的內在質量。利用微生物進行烤煙的人工陳化可以提高陳化效率，對存儲期間烤煙品質的改善具有積極作用，并有待于進一步的深入研究。

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