CRISPR/Cas9基因編輯技術及其在動物細胞系構建中的應用

葛玉鳳 安芳蘭 劉學榮 崔治亮 田波

摘要?CRISPR/Cas9[Clustered ?regular ?interspaced ?short ?palindromic ?repeats（CRISPR）/CRISPR-associated protein 9]系統是廣泛存在于細菌和古生菌中可降解入侵病毒和噬菌體DNA的一種基因定點編輯技術，由于其具有快速、精準、高效，易于設計，且特異性高等優勢，得到了廣泛的應用。概述了CRISPR/Cas9基因編輯技術的發展歷程，并介紹其結構和編輯原理、在動物細胞系構建中的應用及展望，以便為更合理地應用和改進該技術提供系統的文獻參考。

關鍵詞?CRISPR/Cas9基因編輯技術;動物細胞系;構建

中圖分類號?Q789文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2018）35-0009-02

1?CRISPR/Cas9的基因座結構和編輯原理

20世紀80年代，日本學者Nakata在大腸桿菌基因組中發現了一系列的短的間隔序列[1]，但其功能一直未研究清楚。隨著基因測序技術的發展，人們發現這些重復序列廣泛存在于細菌和古細菌基因組中，2002年將其正式命名為CRISPR。直到2008 年，CRISPR/Cas9才被證明具有免疫能力，在E.coli中成熟的crRNAs引導形成Cas蛋白復合體，從而抑制病毒的增殖[2]。2012年，由RNA介導的基因組編輯技術CRISPR/Cas9正式建立，并完成了在哺乳動物細胞中的基因組編輯[3-5] 。

基因編輯技術是通過基因的定點突變，以小片段的刪除及目的基因的插入等方式對基因組進行精確修飾的一種技術，是研究基因功能的重要手段。基因編輯技術經歷了一個長期而艱巨的研發歷程，鋅指核酸酶（ZFNs）是第一代人工核酸內切酶，較傳統的基因敲除技術易于操作，效率高，周期短，曾被應用于動物和細胞的定點修飾和基因敲除，但隨著基因研究技術的發展，ZFNs技術在實際應用中存在制備繁瑣，效能低，成本高的缺點，因此，TALEN技術應運而生。2011年，TALEN技術成功應用于目的基因的編輯[6-8]，該技術應用簡單高效，細胞毒性較小，被廣泛應用于動植物細胞、人細胞及斑馬魚等模式生物的研究中，但該技術的靶點模塊建立較復雜，耗時較長。截至2013年，Cong和Mali將CRISPR/Cas9系統成功應用于人類和小鼠基因組編輯，第三代人工核酸內切酶技術- CRISPR/Cas9技術誕生，并迅速成為各國學者研究的重點基因編輯技術，廣泛應用于各種模式動物模型和細胞系的建立。

CRISPR/Cas9是存在于大多數細菌和古生菌中的一種獲得性免疫系統。由多個重復序列和非重復的間隔序列組成，主要包括R-S結構和編碼cas的基因操作子。R-S結構具有特異性識別外源DNA的功能，cas基因家族可編碼多功能的CRISPR蛋白，并與成熟的crRNA共同作用[9]構建抵御外來病毒入侵的免疫屏障。根據CRISPR/Cas9系統中cas蛋白的不同，將CRISPR/Cas9系統分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3 種類型。I型和III型CRISPR/Cas9系統需要多個Cas蛋白的參與，Ⅱ型CRISPR/Cas9系統僅需要Cas9蛋白即可對DNA特定位點進行修飾，是目前研究的最徹底，也是應用最為廣泛的。其作用機制主要通過三個階段實現：獲得CRISPR可變間隔序列、轉錄crRNA前體與加工crDNA、crRNA-tracrRNA-Cas9復合體剪輯外源性DNA[10]。與傳統的ZFN、TALEN基因編輯技術相比，CRISPR/Cas9系統通過設計不同的RNA向導對基因進行定點修飾，操作簡單易行，高效，基因修飾可遺傳，無物種限制，實驗周期較短，成本較低，對細胞毒性較小，適合于多基因、高通量的操作，可應用在各種不同的細胞和模式生物中，且發生同源重組的概率比自然發生同源重組的概率高。

2?CRISPR/Cas9技術在動物細胞系構建中的應用

隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術的研究深入和不斷完善，該技術已成為動植物基因功能研究、建立細胞系和疾病模型的主要手段，尤其在動物細胞系的建立方面起到了重要的作用，目前，該技術在動物細胞系建立中的應用主要包括基因敲除、基因插入和基因修飾3個方面。

2.1?基因敲除

我國科學家針對豬的酪氨酸酶、PARK2 和PINK1 基因的外顯子設計了Cas9 打靶質粒，獲得了純合的酪氨酸酶基因敲除以及PARK2 和PINK1 雙基因敲除的細胞系，該細胞系用于體細胞核移植后，成功培育出酪氨酸酶基因敲除豬和PARK2 和PINK1 雙基因敲除豬，建立了人類白化病和帕金森綜合征2種豬模型，該研究團隊首次將CRISPR/Cas9技術與體細胞克隆相結合，實現了大型家禽雙基因的等位敲除，這對于人類遺傳性疾病的研究有重大意義[11]。近期，又有中國學者通過CRISPR/Cas9 技術成功構建了酪氨酸酶（TYR）等位基因突變的豬胎兒成纖維細胞系和PARK2 和PINK1雙基因knock-out 的細胞系，成功培養出基因突變的個體，并可穩定遺傳給下一代。韓秋影等[12]利用CRISPR/Cas9 技術實現了細胞水平的基因敲除技術，同時構建了能穩定表達Cas9蛋白的HEK293細胞，并運用CRISPR/Cas9基因轉錄激活技術，使得HEK293 細胞cGAS基因的轉錄激活。MEIS2（一種高度保守的同源盒轉錄因子）可廣泛調控胚胎的早期發育和腫瘤的發生，研究者[13]通過設計2個靶向sgRNA，介導外源Cas9蛋白與基因特異性位點結合，構建了可穩定敲除MEIS2基因的HEK293T細胞株。

2.2?基因敲入

傳統的基因定點敲入是通過同源重組的方式將目的基因整合到細胞基因組中，篩選產量較高的單克隆，但此方法無法精確控制基因的插入位點，因此整合效率較低。CRISPR/Cas9 技術為構建穩定高產的重組細胞提供了可行性。有研究發現CTCF（脊椎動物關鍵的絕緣子蛋白）對動物細胞基因表達調控起著重要的作用，其缺失會導致小鼠胚胎死亡。通過CRISPR/Cas9技術介導的同源重組技術，將MD（有絲分裂期特異性降解結構域）敲入CTCF表達框上游，從而帶動CTCF蛋白周期性持續降解，獲得了CTCF蛋白特異性降解細胞系[14]，體現了CRISPR/Cas9技術對基因組改造的簡易性和特異性。段宇紅[15]等將4種不同的表達PCV2（豬圓環病毒）功能蛋白基因定點插入到PK15細胞的Rosa26位點，從而建立了穩定的可表達PCV2的細胞系，為研究PCV2病毒在哺乳動物細胞中復制水平低的機制奠定了基礎。

2.3?基因修飾

WHO統計結果顯示，目前世界上有近6 000多種疾病與基因發生異常相關，但在臨床上仍缺乏有效的治療體系，由于干細胞具有較強的可塑性和重建能力，因此干細胞基因修飾技術成為構建疾病模型、篩選靶向藥物和制備治療型干細胞的關鍵技術，也成為了人類基因疾病治療的新希望。王曄博[16]等利用CRISPR/Cas9系統編輯原理，在人的多功能干細胞WAN基因第6個內含子的高突變位點區域，設計了2個gRNAs，通過IDLV攜帶模板序列的方法篩選出了同源重組子，其正確率達50%，有效優化了人多功能干細胞中基因編輯效率，為研究發育生物學和某些疾病的機理提供了操作平臺。有學者[17]利用Cas9核酸酶在sgRNA 介導下可引起基因組DNA雙鏈斷裂，從而形成同源重組修復的特性，構建了綠色熒光標記的CD34報告基因293AD細胞系，為后續人體細胞誘導去分化成造血干細胞提供了有利的工具。韓笑等[18]利用gRNA定位，引導Cas9蛋白精確定位進行DNA剪切，并啟動DNA自我修復機制，建立了能穩定表達Cas9蛋白的小鼠胚胎干細胞系，實現了多個位點的同時編輯，同時運用Cas9核酸酶在DNA雙鏈上精確剪切DNA，降低了Cas9剪切DNA的脫靶率，有效提高了應用CRISPR/Cas9技術在胚胎干細胞中進行基因編輯的效率。

因此，高效的基因編輯技術和精確的基因操作方法為構建所需的細胞系提供了必要的手段。目前，CRISPR/Cas9 技術作為近幾年興起的第三代基因編輯技術，日漸廣泛應用于病毒基因組的編輯、細胞系的建立及人類疾病模型的研究等各領域，提供了一種簡單高效的基因重組的篩選方法，極大地推動了基因工程技術的應用研究。

3?展望

CRISPR/Cas9 技術已開發為具有多功能的技術，但在長期的研究應用中發現，CRISPR/Cas9 技術在動植物細胞基因改造及其他應用方面存在著脫靶的風險。而且在基因編輯過程中，CRISPR/Cas9產生DNA雙鏈斷裂的同時可能激活p53蛋白通路，從而導致基因編輯失敗，在臨床治療中產生風險。因此，結合以上對CRISPR/Cas9系統結構和編輯原理、在動物細胞系建立中的應用及存在的問題等現狀的分析，可進一步完善CRISPR/Cas9系統在干細胞中的同源修飾效率、在干細胞中對遺傳性P-globing異常疾病的基因治療及p53基因功能監控等方面的研究，最終為生物醫學領域的疾病研發、精準醫療和個體化醫療提供服務。

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