拓撲替康對早幼粒白血病細胞增殖凋亡的影響

張靜　 王景　 王晉

摘 要：目的： 拓撲替康對早幼粒白血病細胞增殖凋亡的影響；方法： 應用四甲基偶氮唑鹽（MTT）光吸收法分別檢測0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L的TPT分別作用于HL-60細胞后12小時、24小時、36小時、48小時細胞增殖情況，計算增殖抑制率。結果：采用MTT法檢測在同一濃度TPT在不同時間點對HL-60細胞的抑制作用隨時間的延長而增強，與對照組相比較，均有統計學意義（P<0.05）。結論：拓撲替康對HL-60細胞具有增殖抑制作用。

關鍵詞：拓撲替康 細胞增殖 凋亡

中圖分類號：R9 文獻標識碼：A 文章編號：1003-9082（2018）07-0-02

拓撲替康（TPT）以DNA拓撲異構酶Ⅰ為作用靶點的半合成喜樹堿衍生物，是一種新藥，呈水溶性，目前已廣泛應用于多種實體瘤的治療及試用于惡性血液系統疾病的治療[1]，并取得較好療效。白血病是血液系統最常見的惡性腫瘤，近年來發病率越來越高，死亡率也很高[2]，這就嚴重影響了國民健康。但是隨著聯合化療的不斷發展，骨髓移植術的不斷提高，免疫治療及基因治療的不斷改善[3]，急性白血病的治療效果明顯得到了很大的提高。

一、材料與方法

1.材料

1.1細胞株

人源性白血病細胞系HL-60細胞，由中國協和醫科大學腫瘤研究所提供。

1.2 實驗藥物

TPT（注射用鹽酸拓撲替康）：四季青有限公司。

2.方法

2.1細胞培養

采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基在37℃、5%CO2飽和濕度下的恒溫箱中進行常規培養，平均2-3天換液一次，細胞生長良好，取倍增期的細胞進行實驗。

2.2實驗分組

2.2.1細胞培養

選取生長狀態良好、在倍增期的HL-60細胞進行實驗分組，共分為兩組：對照組和實驗組，對照組不加用任何濃度的拓撲替康，實驗組分別加用0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L及0.8?mol/L濃度的拓撲替康，選取作用時間為12h、24h、36h和48h。

2.2.2四甲基偶氮唑鹽光吸收法

用新鮮配制RPMI1640培養基把細胞配制成單個細胞懸液，在96孔培養板中接種，每孔5×104個細胞200?l量，并設置平行孔。

向實驗組中分解加入0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L的拓撲替康，在對照組應加入同等量的生理鹽水。加藥后經過12h、24h、36h、48h分別作用后，每孔加入20?l的MTT溶液，不棄去培養基的條件下，放入37℃和5%CO2孵育箱內孵育4小時，等待檢測。將每組每孔細胞均勻輕輕細細吹打，混勻，移入1.5mlEP管中，離心，再在每孔中加入二甲基亞砜150?l，輕輕搖蕩10min，使其完全得到溶解。然后將混合液再次置入96孔板中，將96孔板放入酶標儀中，選擇波長490nm處，檢測各孔的光吸收值，記錄結果并把結果打印。根據該結果計算增殖抑制率，抑制率=（1-實驗組值/對照組值）×100%來實現的，根據增殖抑制率的結果得出細胞的最適作用濃度和最適作用時間。

二、結果

不同濃度的TPT在不同時間點對HL60細胞生長抑制的MTT結果。

分別采用0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L的TPT研究在不同時間點（12h、24h、36h、48h）對HL-60細胞的抑制作用，MTT結果顯示各濃度值的抑制細胞增殖作用均隨作用時間的延長而增強，各組與對照組相比較，均有統計學意義（P<0.05）。同一濃度TPT在不同時間點抑制率兩兩比較，除36h和48h兩時間點的抑制率比較無統計學意義外（P>0.05），余各時間點對HL-60細胞的抑制率均有統計學意義（P<0.05）。

同一時間點不同濃度的TPT（0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L）對HL-60細胞的增殖抑制作用隨著濃度增高而增強，各組與對照組相比較（P>0.05），各濃度組均具有統計學意義（P<0.05）；進一步對同一時間不同濃度組兩兩之間比較，除0.4?mol/L與0.8?mol/L藥物濃度組在同一時間點抑制率無統計學意義（P>0.05）外，余各濃度組在同一時間點不同濃度兩兩比較均有統計學意義（P<0.05）。

由上述可見，TPT對HL-60細胞生長有抑制作用，其抑制作用具有劑量依賴性和時間依賴性，其作用的最佳時間和最適濃度分別為36h和0.4?mol/L（見表1）。后續試驗均采用0.4?mol/LTPT作用36h的HL-60細胞。

三、討論

拓撲替康（TPT）是1996年在美國上市的半合成抗腫瘤新藥，在臨床上已開始使用，它的臨床作用機制和其它喜樹堿藥物是相似的，因此具有喜樹堿類藥物共同的藥理作用，它是細胞內一種特異性的拓撲異構酶Ⅰ抑制劑已被確定。

近年來，隨著分子診斷學、分子藥理學和分子腫瘤學共同的迅猛發展，各種醫學技術的提高，也促使在白血病等惡性血液病的治療方面也已進入到綜合治療時代，但最基礎最主要的治療方法仍然是化療，綜合治療手段包括聯合化療和免疫治療，也包含基因治療和造血干細胞移植治療等相關治療手段。DNA拓撲異構酶（topoisomerase）是一種對核酸空間結構 實時動態進行調節的一種關鍵酶，拓撲異構酶能夠對核酸生理功能有主導作用，有Ⅰ型拓撲異構酶（ Topo Ⅰ） 和Ⅱ型拓撲異構酶（ Topo Ⅱ） 兩種類型。所表現出來的生物學作用主要通過下述方式來體現，一：調節控制DNA的超螺旋狀態，使其不斷進行變化，并且控制DNA打結，控制DNA解結，使這兩種環鏈體狀態也發生不斷變化，進而不直接地影響波及細胞內核酸代謝過程，導致細胞代謝過程紊亂。二：不間接參和核糖核酸的重組、修復、轉錄等基因的合成過程，還直接加入核糖核酸的復制過程。DNA拓撲異構酶Ⅰ（Topo Ⅰ）是一種單亞基蛋白，位于20號染色體上，分子量為100kD，它參與DNA復制、轉錄、重組和修復等所有關鍵的過程[4]，是生物體內及其重要的細胞核內酶。研究顯示[5]TopoⅠ在非異常的組織中其含量穩定不變，即使是細胞正處于增殖期時候，Topo Ⅰ也會保持在靜止期的兩倍的范圍之內，但在惡性腫瘤組織中，Topo Ⅰ含量顯著上升。基于上述原理，出現了很多以Topo Ⅰ為靶點的與Topo Ⅰ抑制劑相關的藥物，現已將這些藥物運用到治療小細胞肺癌、卵巢癌等實體惡性腫瘤中，當然還有惡性血液病上，臨床療效也被證實療效不錯。近年來，已被很多學者公認為喜樹堿衍生物和紫杉醇和維甲酸類化合物這三樣藥物，具有時代標志意義，三者共同被稱為了20世紀90年代抵抗惡性腫瘤藥物的三大標志性發現[6]。在美國國立癌癥研究所（NCI）中，藥物機制分析電腦網絡系統存在有被稱為所謂的六大抗腫瘤藥物，其中Topo Ⅰ抑制劑就是六大抗腫瘤藥物的其中之一，被列入各國重點藥物研究。如何從天然產物（植物、海洋生物等）中尋找新的化學結構、克服耐藥性及不良反應是新的細胞毒類抗腫瘤藥的發展目標。

該研究觀察了顯微鏡下細胞所發生的形態學變化，檢測了利用MTT法得到的對細胞的增殖抑制率，（表一）本研究通過MTT法探討了拓撲替康對HL-60細胞的增殖抑制的時間和濃度方面進行了實驗。檢測所得的數據顯示：同一時間點不同濃度的TPT對HL-60細胞的抑制作用，隨著濃度的升高，拓撲替康的抑制作用顯得越來增強，與對照組進行統計學分析，差異均達到統計學意義的標準（P<0.05）。

在細胞周期中，拓撲替康于DNA復制前期就特異性地與DNA單鏈斷端上的拓撲異構酶Ⅰ發生特異性結合，阻止了拓撲異構酶Ⅰ修復單鏈斷端，破壞DNA雙鏈結構，最終導致腫瘤細胞死亡。拓撲替康具有廣譜抗腫瘤活性[7]，在治療非霍淋巴瘤、腸癌、肺癌和卵巢癌等各種惡性腫瘤中，拓撲替康已顯示出了有較好的療效。

參考文獻

[1]Beran M， Kantarjian H， et al. Topotecan， a topoisomerase I inhibitor， is active in the treatment of myelodysplastic syndrome and chronic myelomonocytic leukemia. Blood，1996，88（7）：2473-2479

[2]張莉萍，蔣紀愷，劉祥貴. DNA 拓撲異構酶及其抑制劑與細胞調亡. 國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊，1997 ，18 （4） ：181-183

[3]Vey N， Kantarjian H， BeranM， et al. Combination of topotecan With cytarabine or etoposide in patients with refractory or relapsed Acute myeloid leukemia： results of a randomized phaseⅠ/Ⅱstudy. Invest New Drugs，1999，17（1）：89-95

[4]Erler JT， Cawthome CJ， Williams KJ， et al. Hypoxia-mediated down-regulation of Bid and Bax in tumors occurs via hypoxia-inducible factor-1-dependent and –independent mechanisms and contributes to drug resistance [J]. Mol Cell Biol， 2004， 24（7）： 2875-2889.

[5]Cabanill as F. The role of topoisomerase-Ⅰinhibitors in the treatmentof non-Hodgkin′s lymphoma. Semin Hematol， 1999，36[4] ：12-14.

[6]劉秀峰， 秦叔逵， 王琳等，恩度與化療聯合治療多種晚期惡性腫瘤的臨床觀察[J].臨床腫瘤學雜志， 2007 ， 12（4） ：240.

[7]Vaupel P， Mayer A. Hypoxia and anema： effects on tumor biology and treatment resistance. Transfus Clin Biol， 2005，12（1）：5-8.