綠茶水浸出物對PC12細胞的影響

蔡振陸 馮韻然 李星星 李牧 呂海俠

[摘要] 目的 探討綠茶水浸出物對發育期神經細胞存活和增殖的影響。 方法 選取PC12細胞作為毒理學研究的模型，將綠茶于去離子水中100℃連續煮沸3次，留取各次煮沸后的水溶液進行過濾及冷凍干燥，繼而以40倍體積無菌純水溶解，制備綠茶水浸出物。以DMEM培養基對綠茶水浸出物進行100、200、400、800和1600倍稀釋，用于處理PC12細胞。通過觀察細胞形態、繪制細胞生長曲線、CCK-8試劑盒檢測細胞活力、流式細胞儀檢測分析細胞凋亡，Ki67免疫細胞化學染色觀察細胞增殖，分析綠茶水浸出物對PC12細胞的影響。 結果 與低濃度（800倍及1600倍稀釋）綠茶比較，較高濃度（100稀釋）綠茶處理后，PC12細胞貼壁能力下降，死細胞碎屑明顯增多，活細胞數量及細胞活力較對照組明顯下降（P < 0.05），Ki67陽性細胞比例顯著降低（P < 0.05），但細胞凋亡比率與對照組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 高濃度綠茶對PC12細胞的存活和增殖有顯著抑制作用，建議孕期盡量減少飲用濃茶。

[關鍵詞] 綠茶水浸出物；PC12細胞；存活；凋亡；增殖

[中圖分類號] R715.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）05（c）-0004-04

Effect of water extraction of green tea on survival and proliferation of PC12 cells

CAI Zhenlu1 FENG Yunran2 LI Xingxing1 LI Mu3▲ LV Haixia1

1.Institute of Neurobiology， Xi′an Jiaotong University Health Science Center， Shaanxi Province， Xi′an 710061， China；2.the Affiliated Middle School of Shaanxi Normal University， Shaanxi Province， Xi′an 710061， China；3.Department of Obstetrics and Gynecology， the Second Hospital of Xi′an Jiaotong University， Shaanxi Province， Xi′an 710004， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of green tea on the survival and proliferation of neural cells during development. Methods PC12 cells were selected as the cell model for toxicological analysis， green tea leaves were boiled in distill water of 100℃ for three times， tea solution was then filtered and freeze dried. The powder was dissolved with sterilized pure water. DMEM medium was applied to make different concentrations of tea extraction （diluer for 100， 200 400， 800， and 1600 times） before use. The morphology of PC12 cells was observed， cell viability and apoptosis were detected by CCK-8 assay and flow cytometry assay after treatment. The proliferation of PC12 was detected by Ki67 immunostaining. Results Compared with low concentration （diluer 800 and 1600 times）， after treated with green tea extraction in high concentration， PC12 cell morphology changed dramatically and cell viability was decreased significantly （P < 0.05）. Proliferation of PC12 also declined dramatically， as showed by the reduced number of Ki67+ cells （P < 0.05）. While the apoptosis of PC12 had no statistically significant difference compared with control group （P > 0.05）. Conclusion Green tea in high concentration， so it is recommended to reduce the drinking of strong green teadurn pregancy could reduce the survival and proliferation of PC12 cells

[Key words] Water extraction of green tea； PC12 cells； Survival； Apoptosis； Proliferation

中國傳統的茶文化源遠流長，茶水也已成為中國人群普遍接受的飲品。茶葉中含有茶多酚、茶多糖、茶蛋白、生物堿等成分，已被證實具有抗氧化、抗癌等功效[1-6]，備受食品界和醫學界的重視。然而妊娠期婦女是否可以飲茶？茶水對胚胎發育尤其是神經系統發育會產生怎樣的影響？一直是困擾婦產科醫生和妊娠婦女的難題。有實驗證實綠茶有對抗神經損傷的作用[7-8]，然而Ye團隊[9]對北方人群飲茶和胎兒神經管畸形的發生率之間的關系調查結果證實，圍妊娠期間持續每日飲茶者其胎兒發生神經管缺陷的風險明顯增高。究竟飲用茶水是否會影響神經系統的發育？茶水會對神經細胞產生怎樣的影響仍值得探討。

綠茶屬于不發酵茶葉，已經被證實在抗氧化應激損傷以及抗腫瘤等方面發揮重要的作用[1-4，6-8]。本研究選取綠茶作為研究對象，以開水煮沸的方式模擬日常生活中的茶葉沖泡過程。選取大鼠嗜鉻細胞瘤系PC12細胞為神經毒理研究模型，觀察不同濃度的綠茶處理后細胞的存活、凋亡以及增殖情況，分析飲茶對發育期神經系統的可能影響，以期為指導臨床實踐提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與實驗試劑

PC12細胞系夠自美國ATCC細胞庫，由西安交通大學醫學部神經生物研究所保存。綠茶為市售流行品牌。胰蛋白酶、DMEM（高糖）培養基、胎牛血清（（FBS））購自Gibco公司；CCK-8試劑盒購自七海復泰生物科技有限公司；小鼠抗大鼠Ki67單克隆抗體購自Abcam公司（1∶500）、TRITC標記二抗購自北京中杉金橋生物科技有限公司；Hochest33258染液及DAPI購自中國碧云天生物科技有限公司。磷酸鹽緩沖液（PBS）以及4%多聚甲醛由本實驗室配制。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同濃度茶葉水浸出物制備 稱取綠茶干茶葉5.0 g，加入200 mL去離子水，100℃條件下煮沸30 min，每5分鐘晃動1次。連續提取3次后靜置，待顆粒物沉淀，取上清液進行過濾，并于40℃條件下真空干燥。使用前以50 mL滅菌去離子水復溶，取200 μL原液稀釋至1 mL，以0.22 μm微孔濾膜過濾，以DMEM培養基進行100、200、400、800和1600倍稀釋，用于處理PC12細胞。

1.2.2 PC12細胞培養及處理 按常規方法將PC12細胞培養于含10% FBS的DMEM培養液中，5% CO2、37℃條件下培養，待細胞生長至80%～90%匯合時用0.25%胰蛋白酶消化傳代。傳代細胞進入對數生長期后，于培養環境中加入不同濃度的綠茶水浸出物，對照組添加等量培養基。

1.3 PC12細胞活力檢測

PC12細胞傳代接種于96孔培養板，每孔3000個細胞，對進入對數生長期的PC12細胞給予不同濃度的綠茶水浸出物處理。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，連續進行細胞計數并繪制生長曲線；與此同時，于處理后不同時間點，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，37℃孵育50 min，用BIO-RAD680型酶標儀（美國）測定波長450 nm處的吸光度（OD值）。參考以下公式計算細胞存活率：細胞存活率=（實驗組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）×100%。每組實驗至少重復3次。

1.4 PC12細胞凋亡及增殖能力檢測

同上處理PC12細胞，以流式細胞儀檢測細胞凋亡情況；部分細胞傳代于預先經過多聚賴氨酸包被的玻片，置96孔培養板繼續培養3 d后進行Ki76免疫細胞化學染色，觀察細胞增殖情況。

1.5 免疫細胞化學染色

PC12細胞以4%多聚甲醛室溫固定20 min，固定后細胞經PBS洗滌3次，以5%正常山羊血清封閉，甩掉不洗，繼而與1∶500稀釋的單克隆Ki67抗體室溫孵育30 min后于4℃過夜，次日經室溫復溫2 h、PBS洗滌3次后滴加TRITC標記二抗，室溫避光孵育2 h，以含有DAPI的封片劑進行封片，熒光顯微鏡下觀察并計數陽性細胞。陰性對照組以含5%正常山羊血清的PBS代替一抗，分別選取3張染色后玻片，每張玻片計數3個視野，計算陽性細胞占細胞總數百分比。每組實驗至少重復3次。

1.6 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 綠茶水浸出物對PC12細胞生長的影響

正常培養條件下，PC12以貼壁狀態生長，細胞輪廓清晰，胞體和突起折光性強；低濃度（800倍稀釋）綠茶水浸出物處理后細胞形態變化不大，而高濃度（100倍稀釋）綠茶水浸出物處理后細胞貼壁能力下降，死細胞碎屑明顯增多，與對照組比較細胞數量顯著減少（圖1）；生長曲線顯示高濃度綠茶水浸出物處理后PC12細胞數量隨培養時間的延長沒有明顯增加（圖2），與對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.01）。

2.2 綠茶水浸出物對PC12細胞活力的影響

以不同濃度綠茶水浸出物處理PC12細胞，CCK-8檢測結果顯示：高濃度綠茶（0～100倍稀釋）浸出物處理細胞后，細胞活力[OD值：0.30±0.01）]與對照組（0.50±0.08）比較顯著下降，差異有統計學意義（P < 0.05）。相對而言，以中、低濃度綠茶（200～800倍稀釋）處理PC12細胞，細胞活力（0.46±0.08、0.45±0.07、0.48±0.06）與對照組比較無明顯變化，差異無統計學意義（P > 0.05）（圖3）。

2.3 綠茶水浸出物對PC12細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測不同濃度的綠茶水浸出物處理后PC12細胞凋亡情況，結果顯示：對照組細胞凋亡比率為（3.7±0.59）%，高濃度綠茶水浸出物處理后PC12細胞凋亡率為（5.24±1.05）%，兩組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖4。

2.4 綠茶水浸出物對PC12細胞增殖的影響

免疫細胞化學染色的方法觀察茶葉水浸出物處理后細胞增殖的變化，結果顯示：高濃度綠茶水處理組（圖5B，封四），Ki67陽性細胞（正在增殖的細胞）比率為（33.5±2.89）%，與對照組[（79.8±3.95）%，圖5A，封四]比較顯著下降，差異有統計學意義（P < 0.05）。

3 討論

茶葉中富含多種營養成份，本實驗選用未發酵的綠茶，以煮沸方式獲取其浸出物，能更好地模擬日常生活中的茶葉浸泡。已經證實未發酵茶葉經過熱水浸泡后其浸出物以茶多酚和嘌呤類的生物堿為主，而茶多酚有明確的神經保護作用，可以顯著減輕谷氨酸對PC12細胞的興奮性神經毒性[10-13]，對于母親患糖尿病引起的神經管畸形有緩解作用[8]。本實驗為了更好地模擬正常妊娠婦女飲茶，未對細胞做損傷性處理，即重點觀察綠茶水浸出物對正常培養的PC12細胞的影響，具有較高的指導意義。

PC12細胞系源于大鼠嗜鉻細胞瘤，已被廣泛用于神經系統細胞模型[12-20]。本研究觀察不同濃度綠茶水浸出物對PC12細胞存活、凋亡以及增殖等生物學行為的影響，用于分析綠茶對發育中神經系統細胞產生的可能影響。Menezes等[7]的研究證明飲茶可以緩解動物因母嬰分離而引起的認知功能障礙，發揮積極的作用，而Ye等[9]的研究認為茶葉中的茶酸成分可能通過抑制二氫葉酸還原酶的活性而干擾葉酸的代謝，并抑制葉酸在腸道的吸收，從而引起神經管發育異常。發育期大腦神經細胞對外界因素的影響極為敏感，綠茶中的多種成分可能通過不同的途徑影響神經細胞的行為[1，4，12，16]，從而對神經發育產生影響。本研究結果顯示當高濃度綠茶水浸出物處理PC12細胞后，細胞活力以及增殖能力顯著下降，而凋亡細胞比率無顯著性差異，相對來講，淡茶水對PC12細胞行為的影響和對照組比較，差異無統計學意義。上述結果提示孕期婦女如果飲用高濃度綠茶，茶多酚可能通過影響神經細胞的存活和增殖從而影響神經系統的正常發育，必須謹慎。相對而言，低濃度綠茶對細胞的存活和增殖無明顯的影響，相對安全。因此，我們建議妊娠婦女在孕期盡量減少茶水的飲用，如果需要，盡可能以淡茶為主。

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（收稿日期：2018-01-29 本文編輯：任 念）