TWSG1蛋白在頜面骨纖維異常增殖癥患者組織中的表達及其與臨床特征的相關性分析

伊燕軍 徐旭 王真

[摘要] 目的 探討TWSG1蛋白在頜面骨纖維異常增殖癥患者組織中表達及其與臨床特征的相關性。 方法 以本院2010年4月～2013年7月收治的頜面骨纖維異常增殖癥患者44例為病例組，同期選擇口腔科外傷10例正常新鮮頜骨骨折患者作為對照組，酶聯免疫吸附法、免疫組化法測定TWSG1蛋白的表達，分析TWSG1蛋白在各組中的表達水平及其與頜面骨纖維異常增殖癥患者臨床特征（性別、影像CT分類、年齡、病變部位、術后復發）的相關性。 結果 病例組與對照組的性別、年齡、吸煙、飲酒分布及BMI、收縮壓、舒張壓水平相似，差異無統計學意義（P>0.05）;病例組TWSG1蛋白水平表達水平為（146.98±15.14）ng/g，高于對照組（19.87±9.76）ng/g（t=25.281，P<0.01）;病例組TWSG1蛋白陽性率為81.8%，明顯高于對照組的10.0%（χ2=19.483，P<0.01）;TWSG1蛋白表達與性別、影像CT分類相關性不明顯（χ2=0.081、2.546，P>0.05）;與年齡、病變部位、術后復發相關性明顯，年齡<20歲、病變部位為多骨型，TWSG1蛋白陽性表達率越高（χ2=6.210、7.283，P<0.05）;術后有復發頜面骨纖維異常增殖癥患者其TWSG1陽性表達率為92.8%，高于術后未復發者TWSG1陽性表達率（62.5%）（χ2=6.308，P<0.05）。 結論 TWSG1與頜面骨纖維異常增殖癥的進展預后密切相關，其機制可能與TWSG1促進成骨細胞分化有關，TWSG1可能成為頜面骨纖維異常增殖癥治療的分子靶點。

[關鍵詞] TWSG1;頜面骨;纖維異常增殖癥;臨床特征;相關性

[中圖分類號] R782? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）01-0005-04

Expression of TWSG1 protein in tissues of patients with maxillofacial fibrous dysplasia and its correlation with clinical features

YI Yanjun XU Xu WANG Zhen

Department of Stomatology， Quzhou People's Hospital in Zhejiang Province， Quzhou 324000， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of TWSG1 protein in tissues of patients with maxillofacial fibrous dysplasia and its correlation with clinical features. Methods A total of 44 cases of maxillofacial fibrous dysplasia from April 2010 to July 2013 in our hospital were included in the case group. Ten patients with normal fresh jaw fractures who underwent stomatological trauma were selected as control group in the same period. The expression of TWSG1 protein was measured by enzyme-linked immunosorbent assay and immunohistochemistry. And the expression of TWSG1 protein in each group and its correlation with the clinical features of maxillofacial fibrous dysplasia （sex， CT classification， age， lesion location， postoperative recurrence） was analyzed. Results There was no significant difference in gender， age， smoking， alcohol consumption distribution， BMI， systolic blood pressure and diastolic blood pressure between the case group and the control group（P>0.05）. The expression level of TWSG1 protein in the case group was （146.98±15.14） ng/g， which was higher than that （19.87±9.76） ng/g of the control group （t=25.281， P<0.01）.The positive rate of TWSG1 protein in the case group was 81.8%， which was higher than that of the control group （10.0%） （χ2=19.483， P<0.01）. TWSG1 protein expression was not significantly correlated with gender and imaging CT classification（χ2=0.081， 2.546， P>0.05）， while was significantly correlated with age， lesion location， postoperative recurrence. When the age was less than 20 years old， and lesion location was multi-bone type， the positive rate TWSG1 protein expression was higher （χ2=6.210， 7.283， P<0.05）. The positive expression rate of TWSG1 was 92.8% in patients with postoperatively recurrent maxillofacial fibrous dysplasia， which was higher than that of patients who had no recurrence after surgery（62.5%） （χ2=6.308， P<0.05）. Conclusion TWSG1 is closely related to the prognosis of maxillofacial fibrous dysplasia， and its mechanism may be related to the promotion of osteoblast differentiation by TWSG1. TWSG1 may become a molecular target for the treatment of maxillofacial fibrous dysplasia.

[Key words] TWSG1; Maxillofacial bone; Fibrous dysplasia; Clinical features; Correlation

骨纖維異常增殖癥是一種病因不明、進展緩慢、先天非遺傳性的自限性良性骨纖維組織疾病[1-2]。男女均可患病，比例約為1∶2，本病絕大多數發生于20歲以前，病因尚不明確，某些原因導致的局部血液循環障礙、內分泌功能紊亂、外傷、感染可能與之有關[3]。由于骨的間質分化不良、網狀骨未成熟期骨停滯，在病理上表現為質梭形細胞的纖維組織和發育不良的網狀骨骨小梁取代正常骨小梁[4]。臨床上頜面骨纖維異常增殖癥的癥狀如下：頜面部的骨區有畸形腫脹的現象，面部的兩側不對稱，鼻腔變窄，眼球有突出和移位狀況，牙齒會出現松動，隨著病情的加重還會產生頭痛[5]。我國頜面骨纖維異常增殖癥發病率日漸升高，約有86萬患者，嚴重影響了患者的生活質量，每年我國在頜面骨纖維異常增殖癥治療上的支出多達120億元人民幣，給社會帶來沉重負擔[6]。TWSG1蛋白（Twisted Gastrulation，TWSG1）是一種分子量為23.5 KDA的分泌糖蛋白，在細胞外空間與骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）結合，發揮增效和拮抗的作用，進而激活成骨細胞相關功能[7]。TWSG1蛋白在哺乳動物的脂肪組織、血管平滑肌組織、骨骼、心肌組織、胎盤中均有表達，利用各種受體的分子、生長因子以及多功能蛋白，調控細胞的變化過程，促進了細胞的增殖[8]。本研究擬探討TWSG1蛋白在頜面骨纖維異常增殖癥患者組織中表達及其與臨床特征的相關性分析，為頜面骨纖維異常增殖癥的治療提供理論及臨床依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2010年4月～2013年7月在我院口腔頜面外科確診有完整隨訪資料的頜面骨纖維異常增殖癥患者44例，所有患者行輔助檢查：血常規、尿常規、血生化檢查，經臨床表現（頜面骨腫大畸形、病變區域疼痛向周圍反射）、影像CT學及病理學確診，其中毛玻璃樣型16例、結節狀硬化型14例、囊樣型14例。患者病患處竇腔、竇管、竇孔閉塞、變形縮小，正常骨小梁結構溶解消失，覆蓋以密度不均勻的無小梁結構區，皮質變薄。病變部位單一累及上頜骨3例、篩骨4例、下頜骨5例、蝶骨3例;混合累計29例;年齡16～56歲，平均（36.35±11.26）歲，病程4～13年，其中男20例，女24例，吸煙18例、飲酒15例，收縮壓104.35～138.16 mmHg，平均（122.74±19.85）mmHg，舒張壓60.32～89.42 mmHg，平均（68.74±14.91）mmHg，BMI 22.45～23.99 kg/m2，平均（23.54±2.36）kg/m2。44例頜面骨纖維異常增殖癥患者中高血壓7例、冠心病3例、高血脂3例，患者均無既往肺栓塞病史、惡性腫瘤、6周內手術史、下肢外傷史、長期臥床史，簽署知情同意書。選擇同期我院口腔科外傷10例正常新鮮頜骨骨折碎片組織標本作為陰性對照。兩組在性別、年齡、吸煙、飲酒分布及BMI、收縮壓、舒張壓水平方面比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

納入標準：①無精神障礙史，能夠進行自由的溝通與交流;②具備生活自理的能力，在意識方面比較清醒;③各組患者需要對知情書進行簽署，也可由他們的直系親屬代簽。

排除標準：①有較為嚴重的精神病史和心源性休克癥狀;②在本次治療期間，同時有其他放療;③患者心肝功能較弱，存在一些急性的炎癥，或者有血液病。

1.2 ELISA法測定TWSG1蛋白水平

此次實驗所用的器具預先使用高壓進行滅菌和烘干操作，嚴格遵循無菌操作規范。將保存在液氮罐中的病例組頜面骨纖維異常增殖組織及對照組頜骨骨折碎片組織取出解凍。準確稱取0.2 g頜面骨纖維異常增殖組織及頜骨骨折碎片組織，微波粉碎器速將其碾碎至粉末狀;將組織粉末轉入2 mL Eppendorf管中，加入1.5 mL PBS（pH7.4），充分振蕩混勻，2000 g，4℃，靜止1 h，然后離心20 min。仔細收集上清液。獲取頜面骨纖維異常增殖組織及頜骨骨折碎片組織勻漿后， ELISA法（試劑盒購于南京金益柏生物科技有限公司）檢測頜面骨纖維異常增殖組織及頜骨骨折碎片組織中的TWSG1蛋白表達量。

1.3 TWSG1在頜面骨纖維異常增殖組織及頜骨骨折碎片組織中表達水平的測定

免疫組化方法測定TWSG在頜面骨纖維異常增殖組織及頜骨骨折碎片組織中的表達，對骨骼組織常規脫鈣，制作常規5 μm石蠟切片，3% H2O2液常溫阻斷內源性過氧化氫酶活性，微波修復抗原，PBS常規沖洗，1%TWSG抗體工作液（購于英國Abcam公司），4℃過夜，加入二抗（IgG），室溫30 min，加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。TWSG1染色陽性為骨母細胞和成纖維細胞的細胞漿/核，以細胞質呈黃色或棕色者為陽性，無黃染者為陰性。采用雙盲法統計結果，隨機選取5個高倍視野（×400）計數，無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，同時計數;>50%為（+++），26%～50%為（++），6%～25%為（+），陽性細胞≤5%為（-），（-）及（+）歸為不表達組或低表達組，（++）及（+++）歸為高表達組。

1.4 統計學方法

通過Epidata、SPSS19.0導入相關的數據，并進行統計分析。TWSG蛋白以均數±標準差（x±s）進行表示，并預先實施正態檢驗，若正態性得到滿足，則使用t檢驗進行比較，若正態性不能滿足，則在轉換數據之后，進行單因素方差分析，然后使用t檢驗進行比較;TWSG蛋白的表達情況與頜面骨纖維異常增殖癥患者臨床病理特征的關系采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1兩組TWSG1蛋白水平的表達

實驗結果，對照組的TWSG1為（19.87±9.76）ng/g，病例組的TWSG1為（146.98±15.14）ng/g，病例組TWSG1蛋白水平表達水平高于對照組（t=25.281，P<0.01）。

2.2 兩組TWSG1蛋白表達的相關性分析

由表2及封三圖2可見，對照組高倍視野的陽性細胞為10.0%，屬于（+）類，為低表達組;病例組高倍視野的陽性細胞為81.8%，屬于（+++）類，為高表達組。病例組TWSG1蛋白陽性率高于對照組（χ2=19.483，P<0.01）。

2.3 TWSG1蛋白表達與臨床病理特征的關系

由表3可見，TWSG1蛋白表達與性別、影像CT分類相關性不明顯（χ2=0.081、2.546，P>0.05）;與年齡、病變部位相關性明顯，年齡<20歲、病變部位為多骨型，TWSG1蛋白陽性表達率越高（χ2=6.210、7.283，P<0.05）。

2.4 TWSG1蛋白表達與頜面骨纖維異常增殖癥患者術后復發的相關性分析

由表4可見，TWSG1蛋白表達與術后復發相關性明顯，術后有復發，TWSG1蛋白陽性表達率越高（χ2=6.308，P<0.05）。

3 討論

TWSG1是與果蠅蛋白RUNT具有高度同源性的骨相關轉錄因子，對于間充質細胞向成骨細胞的分化以及骨基質的礦化是必不可少的[9]。小鼠TWSG1的缺失可以導致成骨細胞功能障礙，而人類的RUNT基因發生突變，則可產生鎖骨顱骨發育不良綜合征，這是一種常染色體顯性遺傳性疾病，其特征為鎖骨缺失、囟門開放、牙齒多生、身材矮小。TWSG1的分子結構域包括3個部分：1、富含谷氨酰胺/丙氨酸的N-末端區（Q/A）;2、具有與果蠅RUNT蛋白高度同源性的中間RUNT區域;3、含有DNA結合區域以及富含脯氨酸/絲氨酸/蘇氨酸的C-末端區（P/S/T）[10-12]。（P/S/T）區域極其重要，因為TWSG1可通過這一區域激活成骨細胞相關基因，這些基因主要有骨鈣素（Osteocalcin，OCN）、骨唾液酸蛋白（Bone sialoprotein，BSP）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）等[13-14]。

本研究結果顯示，病例組TWSG1蛋白表達水平高于對照組，病例組TWSG1蛋白陽性率高于對照組，這提示TWSG1在頜面骨纖維異常增殖癥中，具有促進成骨細胞分化的作用。TWSG1與成骨細胞相關基因的表達不一致，在時間關系上，TWSG1先于OCN的表達[15];而在前成骨細胞向成骨細胞分化的過程中，成骨細胞標志物OCN、BSP、ALP都急劇增加，但是TWSG1卻沒有顯著變化。這些研究均暗示，TWSG1對成骨細胞相關基因的調控密切相關。

此外，TWSG1對骨纖維細胞的發生與發展起到一定的影響。研究發現：TWSG1能夠促進骨纖維細胞朝一定方向轉移，并對淋巴、上皮、中性粒、內皮等部位的細胞進行激活[16]。TWSG1促進了骨纖維細胞的增殖啟動，抑制細胞的凋亡，它比野生株的增殖能力更高。TWSG1的骨纖維細胞還會粘附在細胞的外基質[17]。有研究發現，IL-8、血管內皮生長因子（VEGF）有可能由TWSG1調控，高表達TWSG1蛋白的成骨細胞可促進IL-8、血管及VEGF的分泌，而VEGF、IL-8在促進骨纖維異常增殖的發展過程中發揮重要作用[18-20]。

本研究結果中，TWSG1蛋白表達與性別、影像CT分類相關性不明顯;與年齡、病變部位、術后復發相關性明顯，年齡<20歲、病變部位為多骨型、術后有復發，則TWSG1蛋白陽性表達率越高，這提示 TWSG1與頜面骨纖維異常增殖癥的進展預后密切相關，綜合TWSG1在骨瘤細胞患者的表達，發現骨瘤細胞患者TWSG1蛋白表達異常增高，且隨著骨瘤細胞患者T分期的進展，TWSG1蛋白表達逐漸增高，TWSG1能夠很好地調控骨瘤細胞的發生與發展，具備了時間和空間的表達特異性，若藥物沉默TWSG1蛋白表達，則不能有效促進骨瘤細胞的生長，說明TWSG1有可能作為頜面骨纖維異常增殖癥治療的分子靶點。

綜上所述，TWSG1與頜面骨纖維異常增殖癥的進展預后密切相關，其機制與TWSG1促進成骨細胞分化有關，TWSG1可能成為頜面骨纖維異常增殖癥治療的分子靶點。

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