循環腫瘤DNA在結直腸癌中的臨床應用及研究進展

余柳瑩 鮑軼

[摘要] 作為液體活檢的一部分，ctDNA檢測因其實時動態、無創、可重復性等優勢，已經被廣泛研究。隨著生活方式的改變，結直腸癌越來越高發，而ctDNA在協助結直腸癌早期診斷，療效監測，復發預防等方面發揮重要作用，這在實現結直腸癌的精準化治療方面有巨大發展潛力。

[關鍵詞] 液體活檢;循環腫瘤DNA;結直腸癌;診斷

[中圖分類號] R735.34? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）01-0161-04

Clinical application and research progress of circulating tumor DNA in colorectal cancer

YU Liuying1， 2? ?BAO Yi1， 2

1.Graduate School of Bengbu Medical College， Bengbu? ?233000， China; 2.Department of Central Laboratory， Jiaxing Second Hospital， Jiaxing? ?314000， China

[Abstract] As part of liquid biopsy， ctDNA detection has been widely studied due to its real-time dynamic， non-invasive and reproducible advantages. With the change of lifestyle， colorectal cancer is getting increasing incidence. While ctDNA plays an important role in assisting early diagnosis of colorectal cancer， monitoring of curative effect， prevention of recurrence， etc.， which has great potential development in achieving accurate treatment of colorectal cancer.

[Key words] Liquid biopsy; Circulating tumor DNA; Colorectal cancer; Diagnosis

近年來，隨著生活環境和方式的改變，我國結直腸癌的發病率越來越高，年輕化趨勢也越來越明顯。據數據統計[1]，2015年我國結直腸癌新發病例376 300人，死亡人數19 100人。如果能早期確診，檢測基因突變，指導用藥，動態實時監測腫瘤復發和轉移，這對于提高患者生存率、改善預后有非常大的價值。

組織病理活檢是確診腫瘤的金標準，但其反映的是腫瘤在某一時間點的狀態，不能動態監測腫瘤的改變，且組織活檢是一種有創手段，可能會使患者出現相應的并發癥。因此，無創且能實時監測腫瘤進展的“液體活檢”技術應運而生，循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）檢測即其中的一種。循環腫瘤DNA不僅可作為結直腸癌的一種生物學標志物，還能監測出基因突變情況，預測結直腸癌的復發與轉移，進行療效和預后評估，對早期診斷、改善患者預后有重要價值。本文就ctDNA在結直腸癌中的臨床應用及研究進展作一綜述。

1 ctDNA的來源與特性

1948年，Mandel和Métais在外周血中發現存在大量的降解的DNA片段，稱為循環游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）[2]，主要來自于壞死或凋亡的細胞，片段長度集中在180～200 bp，可在血液、尿液、痰液、腦脊液、滑膜液、糞便中被檢測到。數十年后，人們發現了循環腫瘤細胞DNA（ctDNA），是指由腫瘤細胞脫落或者凋亡后釋放到血液循環系統中的雙鏈DNA片段。ctDNA為cfDNA的一部分，ctDNA只來源于腫瘤細胞，而cfDNA既可來源于腫瘤細胞也可來源于正常細胞。雖然ctDNA由腫瘤細胞凋亡后釋放，但其在腫瘤患者體內的含量很低，約占整個cfDNA的1%，甚至只有0.01%[3]。同時，其半衰期也很短，只有大約2 h。相關研究表明[4]，ctDNA的遺傳突變信息來自于腫瘤細胞的體細胞突變，故ctDNA所攜帶的腫瘤相關信息與腫瘤組織具有一致的生物學特性。腫瘤的類型、部位、負荷、分期、轉移灶、血管浸潤等因素均會影響ctDNA的量，因而，測量差異較大。ctDNA攜帶患者一定的腫瘤基因信息（包括突變、重排、缺失、插入、基因拷貝數變異、微衛星改變、甲基化等），因此，對其進行相關的分析可為腫瘤的診治提供重要線索。

2 ctDNA的檢測方法

2.1 ctDNA的提取

血漿中ctDNA的提取目前有以下幾種方法：鹽析法、酚-氯仿-異戊醇法、微柱吸附法、磁珠吸附法、Qiagen blood Kit法等。提取方法不同，所得到的DNA效率也不同。其中，硅膠膜吸附柱法最為常用[5]，磁珠法假陽性率高于微柱吸附法，而Qiagen blood Kit法相比其他方法對小片段DNA提取效率最高，穩定性也較好[6]。

2.2 ctDNA的檢測

ctDNA的檢測包括定量和定性檢測。定量檢測主要是指對其總量進行檢測，而定性則包括檢測腫瘤相關基因突變、微衛星不穩定性和雜合性缺失、基因過表達、甲基化、基因組不穩定性、完整性評估、拷貝數變化分析、染色體重排分析等不同方面。因ctDNA占cfDNA的含量較少，故定量檢測時常建立在PCR 技術基礎上，如實時熒光定量PCR、甲基化特異性PCR、數字PCR等。近幾年來，數字PCR一流式技術BEAMing（beads emulsion amplification magnetic）、PAP法，微滴式數字PCR（ddPCR）、全基因組測序、全外顯子測序、深度測序、腫瘤個體化深度測序分析（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq）、液相色譜法、突變擴增阻滯系統（amplification refractory mutation system， ARMS）法、NGS高通量檢測技術等廣泛被用于ctDNA的定性分析檢測。其中，BEAMing法敏感性較高，能檢測出比例在1：10000以下的基因突變，該法已用于臨床試驗[7]。CAPP-Seq法采用二代測序平臺檢測基因組變異并結合RNA探針捕獲技術，大大提高了測序深度，可有效檢測出ALK與ROS1融合在內的各種基因突變[8]。

3 ctDNA在結直腸癌中的應用

3.1 早期篩查和診斷

雖然癌胚抗原（CEA）等指標常作為篩查結直腸腫瘤的一種標記物，但其特異性、敏感性均不是很高，而ctDNA一般存在于腫瘤細胞中，在正常細胞中檢測不出。有研究結果得出[9]，結直腸癌患者血漿ctDNA水平較健康人明顯升高，認為將ctDNA與CEA進行聯合檢測，可作為結直腸癌早期篩查的指標。

3.2 基因突變檢測

在結直腸癌發生發展過程中，包括在腺瘤階段，原癌基因KRAS突變是最早的遺傳改變[10]。在結直腸癌患者的血漿ctDNA也常可檢測到KRAS突變，且ctDNA中KRAS突變狀態與腫瘤組織存在較高的一致性[11]，這對于后期指導患者用藥，個體化治療非常有幫助。有研究分析了206 例轉移性結直腸癌患者ctDNA中KRAS突變情況，結果顯示其敏感性為87.2%，特異性為97.2%[12]。此外，Kidess E等[13]還發現血漿ctDNA可檢測出組織未檢測出的突變位點，同時在預測結直腸癌肝轉移時血漿ctDNA比CEA和影像學檢查更及時，這對于結直腸癌患者來說又是一大福音。

3.3 完整性評估

DNA中的短分散重復序列ALU序列以及cfDNA完整性指數CFDI（即ALU長、短片段含量的比值）可間接反映ctDNA含量，這在結直腸癌診斷中得到廣泛研究。2013年，Da等[14]學者對60例CRC患者及33例健康者進行對照研究，結果顯示，手術組（33例）患者血漿CFDI均值（0.08）顯著大于健康對照組（P<0.01）、非手術組（27例）患者與健康對照組（P=0.019）、手術組與非手術組（P=0.005）以及手術組與健康對照組（P=0.043）。以上幾組血漿CFDI差異均有統計學意義。Hao TB等[15]對結直腸癌患者血漿ctDNA中ALU重復序列進行檢測，發現其ALU247/115明顯高于結腸息肉患者及健康對照者，且術后其含量明顯降低，表明ctDNA的完整性在CRC的診斷中也有一定價值，可用于臨床診斷及療效評估。

3.4 ctDNA甲基化

DNA甲基化是指DNA在甲基轉移酶（DNA methyl transferase，DNMT）的作用下，利用S-腺苷甲硫氨酸的甲基，將甲基基團合成到胞嘧啶的5位碳原子上，從而形成5-甲基胞嘧啶。Grützmann R等[16]與Warren JD等[17]學者開展的早期結直腸癌的回顧性研究中，對比不同分期CRC患病人群的血漿ctDNA中SEPT9啟動子甲基化水平，結果顯示，ctDNA甲基化對CRC診斷的敏感度為72%～90%，特異度為88%～90%。同樣，Danese E等[5]也發現在早期結直腸癌患者中SEPT9啟動子甲基化比率明顯高于KRAS突變的比率，這可能與抑癌基因甲基化比癌基因突變更穩定相關，也可能與腫瘤負荷有關，因此，ctDNA異常甲基化檢測在結直腸癌早期篩查或診斷中的應用已更快的從基礎研究走向臨床。

3.5藥物篩選

有研究報道，ctDNA的濃度與腫瘤負荷呈正相關，與有效藥物治療或手術治療呈負相關。通過ctDNA的基因分析來尋找結直腸癌患者的藥物敏感的突變位點，這對于臨床用藥具有很好的指導意義，如西妥昔單抗對KRAS突變的結腸癌有很好療效[18]。但結直腸癌患者在臨床治療過程中往往會出現耐藥或對藥物抵抗情況，動態監測臨床用藥進展，及時調整藥物治療，能使患者臨床獲益更大。Spindler KL等[19]在檢測結直腸癌患者ctDNA中的KRAS突變情況過程中，發現血漿KRAS的突變狀態或突變量與耐藥相關。另一類似研究發現[12]，原發性結直腸癌患者血漿中的KRAS DNA片段原未檢測出16號密碼子突變，但使用EGFR阻滯劑治療后，患者血漿ctDNA中KRAS的突變頻率顯著升高，檢出率約為46%。Diaz LA等[20]研究中選取KRAS野生型的轉移性CRC患者，經靶向治療后仍有部分患者發生耐藥，發現在治療前檢測患者血漿ctDNA中KRAS基因突變情況，已有低頻亞克隆的突變存在，只是當時受限于某些條件未被檢測出。另外，還可通過定量檢測基因拷貝數的增加來預測療效，例如使用定量PCR檢測轉移性結直腸癌患者血漿ctDNA中KRAS突變水平，低水平的KRAS突變說明使用第三代西妥昔單抗和伊立替康治療后療效尚可，而高水平血漿KRAS突變則提示靶向治療后預后不良或出現耐藥[12]。吳疑等[21]研究發現，轉移性結直腸癌患者使用EGFR單克隆抗體治療后，通過監測ctDNA，可發現其存在RAS/RAF基因變異，說明患者對上訴藥物發生耐藥現象。通過監測結直腸癌患者血漿ctDNA中靶向治療相關基因譜的變化，有望以此來指導臨床治療，調整靶向藥物，實現個體化治療和精準治療。

3.6療效與預后評估

邢寶才等[22]發現，血漿ctDNA能更早且及時的進行療效評估，術前化療的結直腸癌肝轉移患者，血漿ctDNA在化療2周期后即可檢測出顯著下降，而CT評價只能在化療開始后的8～10周后才能進行。有研究[12]檢測了108例行西妥昔單抗和伊立替康聯合化療的轉移性CRC患者治療前血漿ctDNA中KRAS和BRAF基因突變定量基線水平，統計后發現，KRAS突變水平高于75%的患者，相比低突變水平的患者疾病控制率差（P<0.048）。Lecomte T等[23]對37例CRC患者進行生存分析的研究中發現，患者發生KRAS基因突變2年整體生存率僅48%（95%CI為26%～66%），而未發生基因突變者2年整體生存率可達100%。以上兩項研究的COX回歸分析均證實，結直腸癌患者血漿ctDNA中KRAS基因突變是預后的獨立因素，KRAS基因突變水平越高，CRC患者的預后越差，這對有效評估CRC患者預后具有重要價值。

3.7復發監測

ctDNA被認為是結直腸癌切除術后監測復發和殘留病灶的潛在標志物。有研究監測了結直腸癌患者術后2～5年ctDNA的情況，結果顯示術后ctDNA陽性患者腫瘤復發或轉移，而未檢測到ctDNA的患者沒有復發[3]。有研究也得出了類似結論，且認為檢測ctDNA時間應在手術后（一般為手術后6～8周）、輔助治療之前。在對18例結直腸癌患者進行的一項研究中發現，第一次局部切除腫瘤時，患者血漿ctDNA含量沒有降低，第二次完全切除腫瘤時，患者血漿ctDNA含量明顯降低[3]。因此，ctDNA有望成為監測結直腸癌復發和轉移的指標。

4 ctDNA存在的缺點

血漿ctDNA檢測雖然在結直腸癌的早期診斷，基因突變檢測，療效評價，預后評估等方面有較大的價值。但ctDNA檢測本身仍存在一些不足：（1）臨床上暫時沒有統一的標準表明哪一種方法提取和純化ctDNA是最佳的，因此檢測方式不同會導致結果差異較大。（2）ctDNA在血漿中的含量較少，檢測較為困難，需尋找能提高血漿ctDNA富集量的方法。（3）ctDNA尚無準確的閾值來判斷陽性指標，如轉移或者復發等。（4）若ctDNA與影像學檢查、CEA等傳統診斷方法的不一致時，判斷較為困難。而在檢測技術方面也存在一些缺點：（1）檢測技術花費較大，有些患者較難接受。（2）檢測方法較多，醫生和患者較難選擇。（3）檢測技術的許多機制尚未闡明，可靠性有待檢驗。

5 展望

“液體活檢”作為一項新起的前沿技術，在腫瘤的診斷、評估、監測中有巨大潛力[24]。血漿ctDNA檢測作為液體活檢技術的一部分，在結直腸癌的早期篩查、診斷、基因突變檢測、病情及療效評估、監測復發等方面都存在較大的價值。但目前國內外較多的研究還只是停留在小范圍的臨床樣本上，缺乏大數據的統計分析，未能真正的廣泛應用于臨床。故我們需要更多大樣本、前瞻性的研究來證明ctDNA的價值，同時解決ctDNA一些可攻克的困難，從而在臨床上真正實現結直腸癌患者的個體化和精準治療。目前，結直腸癌的患者越來越多，ctDNA也許能成為結直腸癌診斷、治療、動態監測上的一個新的突破點，給廣大患者帶去福音。

[參考文獻]

[1] Chen W. Cancer statistics： updated cancer burden in China[J]. Chinese Journal Of Cancer Research，2015，27（1）：1.

[2] Leon SA，Shapiro B，Sklaroff DM，et al. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy[J]. Cancer Research，1977，37（3）：646-650.

[3] Diehl F，Schmidt K，Choti MA，et al. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics[J]. Nature Medicine，2008， 14（9）：985-990.

[4] Dawson SJ，Tsui DW，Murtaza M，et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer[J]. The New England Journal of Medicine，2013，368（13）：1199-1209.

[5] Danese E，Minicozzi AM，Benati M，et al. Comparison of genetic and epigenetic alterations of primary tumors and matched plasma samples in patients with colorectal cancer[J]. PloS One，2015，10（5）：e0126417.

[6] Devonshire AS，Whale AS，Gutteridge A，et al. Towards standardisation of cell-free DNA measurement in plasma：controls for extraction efficiency，fragment size bias and quantification[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2014，406（26）：6499-6512.

[7] 周斌，辛靈，徐玲，等. 乳腺癌液體活檢的現狀與前景[J].中華外科雜志，2018，56（2）：106-109.

[8] Newman AM，Bratman SV，To J，et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage[J]. Nature Medicine，2014，20（5）：548-554.

[9] Jahr S，Hentze H，Englisch S，et al. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients：quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells[J].Cancer Res，2001，61（4）：1659-1665.

[10] Span M，Moerkerk PT，De Goeij AF，et al. A detailed analysis of K-ras point mutations in relation to tumor progression and survival in colorectal cancer patients[J]. Int J Cancer，1996，69（3）：241-245.

[11] Nie K，Jia Y，Zhang X. Cell-free circulating tumor DNA in plasma/serum of non-small cell lung cancer[J]. Tumour Biology： the Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine，2015，36（1）：7-19.

[12] Bettegowda C，Sausen M，Leary RJ，et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies[J]. Science Translational Medicine，2014，6（224）：224ra24.

[13] Kidess E，Heirich K，Wiggin M，et al. Mutation profiling of tumor DNA from plasma and tumor tissue of colorectal cancer patients with a novel，high-sensitivity multiplexed mutation detection platform[J]. Oncotarget，2015，6（4）：2549-2561.

[14] Da Silva Filho BF，Gurgel AP，Neto Má，et al. Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker of colorectal cancer[J]. Journal of Clinical Pathology，2013，66（9）：775-778.

[15] Hao TB，Shi W，Shen XJ，et al. Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer[J]. British Journal of Cancer，2014，111（8）：1482-1489.

[16] Grützmann R，Molnar B，Pilarsky C，et al. Sensitive detection of colorectal cancer in peripheral blood by septin 9 DNA methylation assay[J]. PloS One，2008，3（11）：e3759.

[17] Warren JD，Xiong W，Bunker AM，et al. Septin 9 methylated DNA is a sensitive and specific blood test for colorectal cancer[J]. BMC Medicine，2011，9：133.

[18] 廖雯俊，毛一雷. 循環腫瘤DNA在臨床運用中的研究進展[J]. 中華醫學雜志，2015，95（42）：3476-3477.

[19] Spindler KL，Pallisgaard N，Vogelius I，et al.Quantitative Cell-Free DNA，KRAS，and BRAF Mutations in Plasma from Patients with Metastatic Colorectal Cancer during Treatment with Cetuximab and Irinotecan[J]. Clinical Cancer Research：an Official Journal of the American Association，2012，18（4）：1177-1185.

[20] Diaz LA，Williams RT，Wu J，et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers[J]. Nature，2012，486（7404）：537-540.

[21] 吳疑，高靜，王晰程，等. 循環腫瘤DNA檢測在轉移性結直腸癌表皮生長因子受體單克隆抗體治療效果監測中的應用價值[J]. 中華消化外科雜志，2018，17（4）：400-404.

[22] 邢寶才，劉偉. 體液檢測在結直腸癌中應用的研究進展[J].中華結直腸疾病電子雜志，2016，5（2）：110-113.

[23] Lecomte T，Berger A，Zinzindohoué F，et al. Detection of free-circulating tumor-associated DNA in plasma of colorectal cancer patients and its association with prognosis[J].Int J Cancer，2002，100（5）：542-548.

[24] 周國鋒. 循環游離DNA在胰腺癌中的臨床應用進展[J].復旦學報（醫學版），2018，45（1）：113-118.