銅-還原碘量法測定薏苡仁可溶性糖含量

王春艷，袁毅，白雪梅

1. 貴州省糧油產品質量監督檢驗站（貴陽 550003）；2. 貴州省質量發展服務中心（貴陽 550003）

薏苡仁又名薏米仁、六谷子、川谷等，為禾本科植物薏苡[Coix lacryma-Jobi L. var. mayuen（Roman.）Stapf]干燥成熟種仁[1]，是中國出口的主要農產品之一[2]，出口薏苡仁主要產于貴州、云南、廣西等地，貴州黔西南州興仁縣稱為中國薏米之鄉。薏苡仁的營養、抗癌藥效價值很高[3-7]，被譽為“世界禾本科之王”[2]。雖然薏苡仁中可溶性糖含量比較低，但可溶性糖含量對其品質鑒定、加工利用以及遺傳育種、植株生長有著極其重要的影響[8]。因此，測定薏苡仁中可溶性糖含量有重要意義。

可溶性糖通常是指葡萄糖、果糖等游離單糖及蔗糖等低聚糖[9]，易溶于水及乙醇溶液，是谷物中的重要組成成分，目前尚未有相關標準方法測定薏苡仁中可溶性糖含量，常見可溶性糖測定標準有NY/T 2742—2015《水果及制品可溶性糖的測定》3, 5-二硝基水楊酸比色法[10]和NY/T 1278—2007《蔬菜及其制品中可溶性糖的測定》銅還原碘量法[11]。尤亮亮等[12]做了銅還原碘量法測定玉米、小麥、高粱中可溶性糖含量的研究，由于3, 5-二硝基水楊酸法測定DNS試劑本身500 nm下有最大吸收，對結果干擾大，谷物中可溶性糖含量一般低于3%，結合相關文獻對可溶性糖研究，選擇蔬菜及其制品中可溶性糖的測定銅還原碘量法來測定薏苡仁中微量可溶性糖含量，并通過單因素試驗考察薏苡仁提取最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品和標準品：薏苡仁采自貴州省黔西南州、安順市、盤州市，云南、廣西，共計35個樣品；葡萄糖（99.9%），天津普瑞邦公司提供。

1.2 試劑

酒石酸鉀鈉、無水碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅、無水硫酸鈉、碘化鉀、碘酸鉀、鹽酸、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅、硫酸、草酸、硫代硫酸鈉，均為分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

500 mg/L葡萄糖標準溶液：準確稱取0.125 0 g于80℃干燥2 h的葡萄糖溶于水，定容至250 mL，現用現配。

堿性銅試劑：在1 L的燒杯中按順序溶解30.0 g酒石酸鉀鈉和30.0 g無水碳酸鈉于200 mL熱水中，再加入40 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，將8.0 g硫酸銅溶于80 mL熱水中，邊攪拌邊加入到上述溶液中，然后煮沸消除溶存的空氣。將120 g污水碳酸鈉溶解于500 mL熱水中煮沸，冷卻后加入到上述銅溶液中。將8.0 g碘化鉀用少量煮沸的水溶解，加入到上述銅溶液中。然后煮沸過的水將燒杯中的溶液全部轉入1 L容量瓶中。準確稱取0.891 7 g于105 ℃烘2 h的碘酸鉀，用煮沸過的水溶解，并轉入上述容量瓶中。最后用煮沸并冷卻的水定容，過濾后備用[11]。

1.3 儀器與設備

CUTEL超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；LW 20數顯恒溫水浴鍋（北京萊伯泰科技股份有限公司）；TDZS-WS臺式離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）；3100波通旋風磨（瑞典Perten公司）；TW 423電子天平（島津公司）；DK-98-Ⅰ恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器公司）；移液器（德國Eppendorf公司）。

1.4 試驗方法

薏苡仁可溶性糖定量方法參照NY/T 1278—2007[5]《蔬菜及其制品中可溶性糖的測定銅》還原碘量法進行。

1.4.1 薏苡仁的預處理

取500 g有代表性薏苡仁，清除雜質，用四分法取樣，混勻，經波通實驗磨粉碎（40目），備用。

1.4.2 可溶性糖提取的單因素試驗方法

1.4.2.1 提取溶劑的選擇方法

可溶性糖易溶解于水及乙醇，NY/T 2742—2015[10]、NY/T 1278—2007[11]以及相關測定可溶性糖的方法[13-19]中常用的提取溶劑為水和80%乙醇，故提取溶劑的考察選擇水和80%乙醇溶液。

取5 g（精確至0.001 g）薏苡仁細粉，置250 mL錐形瓶中，加100 mL提取溶劑，置于45 ℃水浴中振蕩提取60 min，冷卻后靜置。移液器吸取50 mL上清液于100 mL蒸發皿中，置于70 ℃水浴上蒸發除去乙醇，至3 mL左右，加入蛋白沉淀劑15%亞鐵氰化鉀溶液和30%硫酸鋅溶液各1 mL，搖勻。用蒸餾水洗入100 mL容量瓶中，定容過濾，取40 mL濾液于50 mL容量瓶中，加入1 mL 1 moL/L鹽酸溶液，沸水浴水解10 min，冷卻，加入2滴酚酞指示劑，用約0.5 mol/L氫氧化鈉中和至紅色，再用1 moL/L稀鹽酸調至紅色剛剛消失，定容，過濾備用；提取溶劑為水時，無需揮發，直接吸取50 mL上清液于100 mL容量瓶中，后續操作同加入蛋白沉淀劑一致。

1.4.2.2 提取方式的考察方法

可溶性糖的提取結合標準方法[20-23]及文獻[8]，采用水浴振蕩提取和超聲提取。分別取兩組5 g薏苡仁細粉，置于250 mL錐形瓶，加入80 mL水，分別于45 ℃恒溫水浴振蕩和45 ℃超聲提取60 min，放冷，定容，混勻，靜置。取50 mL上清液于100 mL容量瓶中，加水至刻度，過濾，取40 mL濾液于50 mL容量瓶中，加入1 mL 1 moL/L鹽酸溶液，沸水浴水解10 min，冷卻，加入2滴酚酞指示劑，用約0.5 mol/L氫氧化鈉中和至紅色，再用1 mol/L稀鹽酸調至紅色剛剛消失，定容，即得供試品溶液，每組樣品取3份平行試樣。

1.4.2.3 不同提取時間的考察方法

分別取6份5 g薏苡仁細粉，置250 mL錐形瓶中，加100 mL提取溶劑，分別于45 ℃水浴中振蕩提取15，30，40，60，75，90，105和120 min，靜置冷卻。量取50 mL上清液置100 mL容量瓶中，照“1.4.2.2”項下自“加水至刻度”起處理樣品。

1.4.3 銅還原碘量法的方法學考察方法

1.4.3.1 葡萄糖標準溶液的配制

精確稱取0.102 5 g干燥恒質量（100 ℃）的葡萄糖，加適量去離子水的溶解，轉移至250 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，配成質量濃度為0.5 mg/mL的標準葡萄糖溶液，備用。

1.4.3.2 葡萄糖標準溶液的滴定

用移液管吸取0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL葡萄糖標準溶液于100 mL錐形瓶里，各加水至總體積5.0 mL，加入5.00 mL銅試劑，錐形瓶或試管口上加蓋小漏斗，用相應的架子固定，置沸水浴中加熱15 min。取出后立即置于冷水中，冷卻至常溫，沿壁加入2 mL硫酸+草酸混合液，立即搖動，使氧化亞銅沉淀完全溶解。當用0.005 mol/L的硫代硫酸鈉工作溶液滴定至淺黃綠色時，加入約0.5 mL淀粉指示劑，滴定至藍色消失為終點。以空白試驗與標準葡萄糖液滴定值差為縱坐標，繪制標準曲線。

1.4.3.3 薏苡仁可溶性糖的測定方法

用移液管吸取1～5 mL濾液于錐形瓶中，加水至5.00 mL，加入5.00 mL銅試劑，以下按上述“1.4.3.2”標準曲線的制作起操作，記錄滴定值V，同時以水代替試樣做空白，將空白試驗與試樣滴定差值代入回歸方程即可求得試樣中可溶性糖質量濃度（mg/mL），薏苡仁可溶性糖含量按式（1）計算。

式中：X表示樣品中可溶性糖的含量，%；A表示將空白與樣品滴定值差代入標準曲線求得樣液中葡萄糖的質量，mg；m表示樣品質量，g；V表示測定時吸取的樣液體積，mL；H表示樣品水分含量，%。

取兩次測定結果的平均值，計算結果保留到小數點后兩位。如試樣與銅試劑加熱反應后，磚紅色氧化亞銅沉淀較多看不到藍色，則樣品含糖量偏高，可酌情吸取1～4 mL樣液，加水至5.00 mL測定，滴定值應不高于標準曲線的最高點。

1.4.3.4 精密度考察方法

選取黔西南州Q2018001、Q2018002樣品，按“1.4.2.1”項下方法制成樣品溶液，分別取2 mL濾液于150 mL錐形瓶里，照“1.4.3.2”項下“加水至5 mL”起依法測定硫代硫酸鈉消耗體積，同法平行操作6份，得出平均消耗體積，計算樣品含量及變異系數（%）。

1.4.3.5 樣品處理液穩定性考察方法

取樣品水解液，過濾，在室溫下放置0，10，20，30和60 min，分別取2 mL濾液于150 mL錐形瓶里，照“1.4.3.2”項下“加水至5 mL”起依法測定硫代硫酸鈉消耗體積，同法平行操作3份，得出平均消耗體積。

1.4.3.6 加樣回收率考察方法

準確稱取12份同一份薏苡仁樣品，分4組，其中3組分別加入25，50和100 mg三個不同梯度的葡萄糖，按“1.4.2.1”項下方法制成樣品溶液，分別取2 mL濾液于150 mL錐形瓶里，照“1.4.3.2”項下“加水至5 mL”起依法測定硫代硫酸鈉消耗體積，同法平行操作3份，得出平均消耗體積，計算可溶性糖含量。

1.4.3.7 標準曲線穩定性考察方法

在間隔3個月后，重新配置葡萄糖標準溶液，按“1.4.3.2”項下制作標準曲線。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑及溫度的選擇結果

在45 ℃條件下，兩種提取溶劑測定薏苡仁可溶性糖含量結果見表1。兩種提取液對薏苡仁可溶性糖的測定結果相差不大，平行測定3次的結果差值為0.20%，絕對差值不超過算術平均值的5%。因此，水和80%的乙醇均可用于薏苡仁可溶性糖的提取。但提取溶劑為80%乙醇時，處理過程需要將80%乙醇水浴揮干，耗時長約3 h；然而，當提取溶劑為水時，不需要揮發，為節約處理樣品時間，提取溶劑選擇水。

由于薏苡仁中淀粉含量較高，平均約50%，淀粉不溶于冷水，在高溫高壓下易溶于熱水，參考GB 5009.7—2016[24]及GB/T 5513—2008[25]，含淀粉的食品測定還原糖時，提取溫度為45 ℃，因此薏苡仁提取溫度選擇為45 ℃。

表1 兩種提取液測定薏苡仁可溶性糖含量結果

2.2 提取方式的考察結果

超聲提取和水浴振蕩提取，薏苡仁可溶性糖含量平均值分別為：2.38%，RSD=4.20%（n=3）；2.48%，RSD=4.03%（n=3）。這兩種提取方式RSD值均小于5%，結果并無顯著性差異，由于超聲提取噪音較大，運行時間超過1 h后，超聲波機體溫度升高，不利于提取溫度的控制，故提取方式選擇水浴振蕩。

2.3 不同提取時間的考察結果

由圖1可以看出，不同提取時間對薏苡仁可溶性糖提取有一定影響。提取時間在15～60 min范圍內，可溶性糖含量隨著時間的延長而大幅度提高，60 min后趨于平穩。這說明隨著時間的延長，提取溶劑較好地滲入薏苡仁顆粒的組織和細胞中，使其充分溶脹，骨架結構伸展，可溶性糖充分溶出，提取時間的延長，其提取效率接近極限，不再增加。因此，水浴振蕩時間選擇60 min。

圖1 不同提取時間對薏苡仁可溶性糖含量的影響

2.4 方法學考察結果

2.4.1 標準曲線的繪制與薏苡仁可溶性糖的測定結果

如圖2所示，經Excel表格數據處理，葡萄糖標準曲線回歸方程y=4.902 9x+0.238 1，R2=0.998 8。結果表明葡萄糖含量在0～2.5 mg范圍內線性關系良好。

圖2 葡萄糖標準曲線

2.4.2 薏苡仁可溶性糖的測定結果

根據以上單因素試驗考察結果，薏苡仁中可溶性糖提取條件為：取5 g（精確至0.001 g）薏苡仁細粉，置250 mL錐形瓶中，加100 mL提取溶劑，置于45 ℃水浴中振蕩提取60 min，冷卻后靜置。移液器吸取50 mL上清液于100 mL容量瓶中，加入蛋白沉淀劑15%亞鐵氰化鉀溶液和30%硫酸鋅溶液各1 mL，搖勻，定容過濾，取40 mL濾液于50 mL容量瓶中，加入1 mL 1 moL/L鹽酸溶液，沸水浴水解10 min，冷卻，加入2滴酚酞指示劑，用約0.5 mol/L氫氧化鈉中和至紅色，再用1 mol/L稀鹽酸調至紅色剛剛消失，定容，過濾備用。按1.4.3.3測定計算結果，最終35批次薏苡仁可溶性糖含量見表2。

2.4.3 精密度試驗結果

選取黔西南州Q2018001、Q2018002樣品，按照上述方法進行檢測，測定結果見表3。結果表明，使用銅還原碘量法測定的結果具有良好的重復性，變異系數小于5%。

表2 薏仁米中可溶性糖質量分數 %

表3 精密度試驗結果

2.4.4 樣品處理液穩定性考察結果

精密吸取2 mL濾液在室溫下放置0，10，20，30和60 min，按照“1.4.3.2”項下“加水至5 mL”起依法測定硫代硫酸鈉消耗體積，結果顯示RSD為1.6%，表明樣品處理液在室溫下放置1 h內穩定性良好。

2.4.5 加標回收率考察結果

準確稱取12份同一薏苡仁樣品，分成4組，其中1組為本底，2，3和4組各添加一定量的葡萄糖，每個水平重復3次，結果如表4所示。回收率在89.5%～95.4%之間，平均回收率為91.6%。

表4 加標回收率結果

2.4.6 標準曲線穩定性考察結果

在間隔3個月后，重新配置葡萄糖標準溶液，硫代硫酸鈉所耗體積與3個月前一致，表明銅試劑在3個月內穩定，重復測樣時，標準曲線可不用重新制作。

3 討論

含淀粉類樣品測定可溶性糖時，提取溶劑多為80%的乙醇，但后續處理過程需要揮干乙醇，耗時較長，試驗選擇水為提取溶劑，無需揮發，減少試驗操作時間。在間隔3個月后重新取銅試劑制作葡萄糖標準曲線，硫代硫酸鈉所耗體積與3個月前一致，表明銅試劑在3個月內穩定，重復測樣時，標準曲線可不用重新制作。

對于檢出限的確證，根據文獻[26]，檢出限大多是空白溶液的測試上線，即能與空白溶液有明顯差別。此次試驗中空白溶液消耗硫代硫酸鈉的體積為22.0 mL，檢出限確證試驗為：在100 mL水溶液中加入1 mg葡萄糖，按“1.4.2.1”項下方法制成樣品溶液，分別取5 mL濾液于150 mL錐形瓶里，按照“1.4.3.2”項下“加水至5 mL”起依法測定硫代硫酸鈉消耗體積，平行操作3份，消耗的硫代硫酸鈉體積分別為21.7，21.6和21.6 mL，與空白值22.0 mL有差異，因此，此方法對可溶性糖含量的檢出限為0.2 mg/g。

4 結論

通過單因素試驗，優化確定薏苡仁可溶性糖的最佳提取條件：取5 g薏苡仁細粉，置250 mL錐形瓶中，加100 mL水（提取溶劑），置于45 ℃水浴中振蕩提取60 min。并依據標準NY/T 1278—2007，探索銅還原碘量法測定薏苡仁可溶性糖含量的適用性，做方法學考察試驗。結果表明，此方法靈敏度高，穩定性強，重復性好，銅還原碘量法適用于薏苡仁可溶性糖含量測定。在此基礎上測定35批次薏苡仁可溶性糖含量，結果均在3%以下，且各地區薏苡仁可溶性糖含量不同，黔西南州薏苡仁可溶性糖含量最高值達到2.99%，安順和盤州兩地薏苡可溶性糖含量均在1%以下，省外云南、廣西兩地，由于樣品數量有限，代表性不強，需做進一步樣品收集。研究為后續薏苡仁品質資源開發，標準制定奠定了基礎。