香味茶花遠(yuǎn)緣雜交親本云南核果茶Pyrenaria yunnanensis Hu香氣成分分析

樊玉花　瞿素萍　王珍珍　李樹發(fā)　蔡艷飛

摘要：芳香味是評(píng)價(jià)名優(yōu)茶花品種的重要園藝性狀，培育具有芳香味的茶花品種是茶花育種的重要研究方向。采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（GC/MS）聯(lián)用儀測(cè)定技術(shù)對(duì)香味茶花遠(yuǎn)緣雜交親本云南核果茶（Pyrenaria yunnanensis Hu）香氣成分進(jìn)行分析，共鑒定出32種香氣化合物，可分為醇類、萜烯類、酯類、烷烴類、酮類和芳香烴類6類。其中，醇類化合物含量最高，占香氣總成分的68.19%，香氣主體成分為芳樟醇、1，8-桉葉素、苯乙醇、癸酸乙酯、十二甲基環(huán)六硅氧烷、檜烯、氧化芳樟醇、1-己醇8種化合物。研究結(jié)果明確了云南核果茶的花香成分，為芳香茶花品種的選育提供理論依據(jù)，同時(shí)為茶花花香成分代謝途徑關(guān)鍵酶基因的克隆和后續(xù)的分子育種奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：香味茶花;云南核果茶;花香成分;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀

中圖分類號(hào)：S685.140.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）02-0192-05

收稿日期：2018-12-04

作者簡(jiǎn)介：樊玉花（1993—），女，云南玉溪人，碩士研究生，主要從事木本觀賞植物的遺傳育種研究。E-mail：1113441589@qq.com。

通信作者：蔡艷飛，博士，副研究員，主要從事高山杜鵑和茶花的栽培及遺傳育種研究。E-mail：caiyanfei1013@126.com。

山茶（Camellia L.）花色艷麗、花容嬌美、密葉蒼綠、經(jīng)冬不凋，不僅是世界著名的觀賞花卉，也是我國傳統(tǒng)十大名花之一。具有怡人的芳香味是名優(yōu)茶花品種的重要園藝性狀[1]，然而，在已經(jīng)登錄在冊(cè)的2萬余個(gè)茶花品種中，具有芳香氣味的茶花品種只有21個(gè)，如烈香（High Fragrance）、瑪麗安（Mariann）、克瑞墨大牡丹（Kramers supreme）等，絕大多數(shù)茶花品種都沒有芳香氣味[2]。培育花色豐富且具有芳香氣味的茶花品種已成為茶花育種的重要趨勢(shì)。然而，山茶屬植物中僅有少數(shù)幾個(gè)種或品種具有明顯的芳香氣味，對(duì)這些資源的重視度和開發(fā)研究均較少。充分發(fā)掘帶香味的近緣野生資源，開展遠(yuǎn)緣雜交，則有可能培育出具有芳香味的茶花育種中間材料或茶花新品種。

云南核果茶（Pyrenaria yunnanensis Hu）屬于山茶科（Theaeeae）核果茶屬（Prenaria BI.）常綠灌木或喬木，分布于海拔1 600～2 400 m的山坡闊葉林，其花呈白色，單生于上部葉腋，具有濃郁的芳香味，且花期在5月[3]。前期筆者所在課題組以具有芳香味的云南核果茶為母本，無香味的云南山茶品種獅子頭（Lion Head）、早桃紅（Early Crimson）、靖安茶（Jingan Camellia）、帕克斯博士（Dr. Clifford Parks）為父本進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，成功獲得了一定數(shù)量的遠(yuǎn)緣雜交后代植株。通過表型觀測(cè)，雜交后代植株也具有芳香氣味，但其母本云南核果茶的香氣組成成分并不清楚。

目前，對(duì)許多帶有芳香氣味的植物花的揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析，如香水月季復(fù)合群（Rosa odorata complex）[4]、桂花（Osmanthus fragrans L.）[5-6]、小蒼蘭（Fressia hybrida）[7]、杜鵑（Rhododendron L.）[8]等都有過研究，對(duì)山茶屬茶樹（C. sinensis L.）的茶葉香味成分做過分析[9-11]，對(duì)普洱大葉種喬木茶（C. sinensis var. assamica）花的香氣成分也進(jìn)行了分析[12]，但對(duì)于山茶花的花香成分分析僅報(bào)道了芳香茶花品種克瑞墨大牡丹。

本研究以云南核果茶盛花期花瓣為試料，利用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定技術(shù)對(duì)其香氣成分進(jìn)行分析，不僅可以了解云南核果茶的花香成分，為芳香茶花品種的選育提供理論指導(dǎo)，同時(shí)為進(jìn)一步了解茶花花香成分代謝途徑關(guān)鍵酶基因和后續(xù)的分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料供試材料為云南核果茶（圖1），樹齡8年，樹高經(jīng)修剪后為2～3 m，以苗木形式保存于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所茶花種質(zhì)資源圃。于12：00采摘云南核果茶花朵樣品，開放程度為盛花。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 頂空固相微萃取 頂空固相微萃取參照林榕燕等的方法[7，13]，首先對(duì)固相微萃取頭（headspace solid phase micro extraction，SPME;100 μm PDMS纖維，Supelco，USA）進(jìn)行預(yù)處理，將100 μm PDMS/DVB萃取纖維在氣相色譜進(jìn)樣口 250 ℃ 條件下老化60 min。然后稱取1 g茶花花瓣，塞入收集瓶中，將收集瓶放入40 ℃水浴中，插入SPME萃取頭，萃取40 min。

1.2.2 GC/MS檢測(cè) 萃取完成后，用Trace DSQ-GC-MS氣相/質(zhì)譜聯(lián)用儀（Thermo Corporation，USA）進(jìn)行GC-MS分析，GC/MS檢測(cè)參照李晉華等的方法[4，10]，氣相色譜條件如下：色譜柱采用 DB-5MS 熔融石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm）;進(jìn)樣口溫度為250 ℃，運(yùn)載氣體為 99.99% 氦氣，1 mL/min的流速進(jìn)行不分流進(jìn)樣;程序升溫：保持5 min的50 ℃初始柱溫，以3 ℃/min的速度升至 210 ℃，平衡3 min，然后再以15 ℃/min的速度升至230 ℃，最后在230 ℃保持8 min。

質(zhì)譜條件：EI為離子源，電子能量70 eV，離子源溫度為230 ℃，四級(jí)桿溫度為150 ℃，接口溫度為280 ℃，電子倍增器電壓為350 V，m/z為35～400進(jìn)行質(zhì)量掃描，2.8 min溶劑延遲。

1.3 數(shù)據(jù)分析

花瓣萃取后經(jīng)GC/MS分析，并將GC/MS分析得到的數(shù)據(jù)在NIST 08.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫上進(jìn)行檢索，對(duì)照擬合指數(shù)，結(jié)合標(biāo)樣進(jìn)行定性分析。運(yùn)用峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析，得到各組分的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 花香成分分析

云南核果茶花香成分的GC/MS總離子流色譜圖如圖2所示，每個(gè)峰表示1種化合物。從盛花期的花瓣中共檢測(cè)出了32種化合物，檢出的主要芳香成分及相對(duì)含量見表1。從圖2和表1可以看出，云南核果茶的香氣成分比較復(fù)雜，相對(duì)含量差異較大，最高的有28.93%，最低的只有0.16%。出峰時(shí)間按分子量由大到小的順序排列，分子量小的先出峰，環(huán)狀的出峰比鏈狀晚，有雙鍵的出峰比無雙鍵的晚，直鏈的出峰比支鏈晚。在檢測(cè)出的化合物中有多組化合物是同分異構(gòu)體，如分子量為170的有2個(gè)，均為醇類化合物;分子量為136的有7個(gè)，均為萜烯類化合物。

在檢測(cè)出的32種化合物中，醇類化合物最多，有12種;萜烯類化合物次之，有9種;酯類、烷烴類、酮類化合物的數(shù)量基本一致，酯類化合物有3種，烷烴類化合物有4種，酮類化合物有3種;芳香烴類化合物最少，僅有1種。

2.2 花香化合物組分含量及分類

云南核果茶花瓣中檢測(cè)到的32種化合物可以分為醇類化合物（68.19%）、酯類化合物（9.69%），烷烴類化合物（7.66%）、酮類化合物（2.87%）、萜烯類化合物（10.53%）和芳香烴類化合物（0.63%）共6類（圖3）。結(jié)合表1和圖3可以看出，花香化合物組分多的相對(duì)含量較高，組分少的相對(duì)含量較低，如醇類化合物的組分最多，為12種，其相對(duì)含量為 68.19%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他化合物總和，在香氣成分中占主導(dǎo)地位;萜烯類化合物為9種，其相對(duì)含量為10.53%;芳香烴類化合物僅有1種，其相對(duì)含量?jī)H為0.63%。

2.3 云南核果茶香氣的主體成分

如表1和圖3所示，云南核果茶香氣成分中含量最高的為醇類化合物。在檢出的醇類化合物中，主要為芳樟醇（28.93%）、1，8-桉葉素（13.21%）、苯乙醇（11.20%）、氧化芳樟醇（4.63%）、1-己醇（4.55%）5種。在其他化合物中，相對(duì)含量較高的還有癸酸乙酯（6.31%）、十二甲基環(huán)六硅氧烷（5.41%）和檜烯（5.09%），其相對(duì)含量均在4.00%以上（表2）。上述8種化合物相對(duì)含量占香氣成分的79.33%，其余24種化合物占總香氣成分的20.67%。因此，云南核果茶的香氣主體成分為表2中所列出的8種化合物，其中，又以芳樟醇含量最高，其相對(duì)含量為28.93%，明顯高于排在第2位的1，8-桉葉素（相對(duì)含量為13.21%）。因此，在云南核果茶的香氣成分中，芳樟醇起主導(dǎo)作用。

3 討論與結(jié)論

芳香氣味是評(píng)價(jià)名優(yōu)茶花品種的重要園藝性狀，但在茶花品種中帶有芳香氣味的品種極少，培育帶有芳香氣味的茶花品種已成為茶花育種的重要目標(biāo)之一。前期研究發(fā)現(xiàn)，云南核果茶具有濃郁的芳香味，并且在前期的育種工作中也發(fā)現(xiàn)以其為親本的遠(yuǎn)緣雜交后代植株也帶有芳香味，對(duì)其進(jìn)行花香成分分析，將為芳香味茶花品種的培育奠定基礎(chǔ)。

本研究通過頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定技術(shù)，首次分析了云南核果茶盛花期花瓣的花香成分，得到32種香氣化合物。其中，醇類化合物的相對(duì)含量居首位，醇類化合物中又以芳樟醇的含量最高，相對(duì)含量達(dá)28.93%，其他的香氣主體成分還有1，8-桉葉素、苯乙醇、癸酸乙酯、十二甲基環(huán)六硅氧烷、檜烯、氧化芳樟醇、1-己醇等，這些揮發(fā)性物質(zhì)一起構(gòu)成了云南核果茶濃郁獨(dú)特的芳香氣味。

本研究的結(jié)果和其他芳香型植物存在一定異同處。香水月季復(fù)合群的主體香氣成分為苯乙醇、2-苯乙醇和香葉醇、橙花醇等單萜醇類[4]，苯乙醇是香水月季復(fù)合群的主要芳香成分，具有清甜的玫瑰樣花香[14];桂花中的花香則主要源自萜烯類物質(zhì)[5];在杜鵑花中，1，8-桉油酸、丁香酚、β-蒎烯的相對(duì)含量較高[8];小蒼蘭中香味的主要成分是醇類跟烯烴類化合物，并且以芳樟醇的貢獻(xiàn)率最大[7]。云南核果茶中香味成分主要為醇類，且主體成分為芳樟醇，這與范正琪等對(duì)芳香味的茶花品種克瑞墨大牡丹的主體花香成分分析結(jié)果[1]一致，說明云南核果茶與克瑞墨大牡丹的香型類似。此外，在對(duì)普洱大葉種喬木茶花香氣成分的分析中也發(fā)現(xiàn)芳樟醇為主要成分[12]。芳樟醇具有鈴蘭類的鮮爽型花香，芳樟醇氧化物則具有百合花或玉蘭花香型[15]，1，8-桉葉素具有樟腦氣息和清涼的草藥味，苯乙醇具有清甜的玫瑰樣花香;在云南核果茶中檢測(cè)出的香氣成分中，相對(duì)含量較少的松油醇具有紫丁香香型，2-庚酮有類似梨的水果香味[14]，這些香型共同組成了云南核果茶獨(dú)特的香味和香型。

云南核果茶香味濃郁獨(dú)特，其揮發(fā)性成分可以用于開發(fā)香料、精油、化妝品、生活用品。此外，云南核果茶已與其他茶花成功進(jìn)行了遠(yuǎn)緣雜交，獲得了雜交后代植株，這為培育芳香型茶花品種提供了重要的育種親本和中間材料。

獨(dú)特濃郁的芳香味、純白色的花朵、5月開花等特性賦予了云南核果茶作為香味茶花遠(yuǎn)緣雜交親本的重要育種價(jià)值。以云南核果茶為茶花遠(yuǎn)緣雜交的育種親本，有望培育花期不同且?guī)в蟹枷阄兜拿麅?yōu)茶花品種。本研究對(duì)云南核果茶的花香成分進(jìn)行分析，共鑒定出32種香氣化合物，以醇類化合物的相對(duì)含量最高，其中，又以芳樟醇的含量最高。研究結(jié)果明確了云南核果茶的花香主體成分，不僅為進(jìn)一步開展茶花花香育種奠定基礎(chǔ)，還可以為進(jìn)一步了解茶花花香成分代謝途徑關(guān)鍵酶基因和后續(xù)的分子育種奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]范正琪，李紀(jì)元，田 敏，等. 山茶品種“克瑞墨大牡丹”香氣成分分析[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，2005，18（4）：412-415.

[2]高繼銀. 芳香茶花品種介紹[J]. 花木盆景（花卉園藝），2001（3）：62-63.

[3]中國科學(xué)院昆明植物研究所.云南植物志： 第八卷[M]. 北京：科學(xué)出版社，1997.

[4]李晉華，晏慧君，楊錦紅，等. 香水月季復(fù)合群（Rosa odorata Complex）花香成分分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，31（3）：587-591.

[5]鄒晶晶，蔡 璇，曾祥玲，等. 桂花不同品種開花過程中香氣活性物質(zhì)的變化[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2017，44（8）：1517-1534.

[6]施婷婷，楊秀蓮，王良桂. ‘波葉金桂花香成分的釋放規(guī)律[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2018，42（2）：97-104.

[7]林榕燕，鐘淮欽，黃敏玲，等. 小蒼蘭品種花香成分分析[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，31（11）：1216-1220.

[8]蒲自連，梁 健. 淡黃杜鵑植物揮發(fā)油化學(xué)成分的研究[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，1999，5（4）：371-373.

[9]Wang L F，Lee J Y，Chung J O，et al. Discrimination of teas with different degrees of fermentation by SPME-GC analysis of the characteristic volatile flavour compounds[J]. Food Chemistry，2008，109（1）：196-206.

[10]Lyu S D，Wu Y S，Zhou J S，et al. Analysis of aroma components of dark teas from five different production regions by fully automatic headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Chemical & Pharmaceutical Research，2014，6（1）：246-253.

[11]石渝鳳，邸太妹，楊紹蘭，等. 花香型紅茶加工過程中香氣成分變化分析[J]. 食品科學(xué)，2018，39（8）：167-175.

[12]王 晨，呂世懂，廉 明，等. 頂空固相微萃取結(jié)合GC/MS分析普洱大葉種喬木茶花香氣成分[J]. 茶葉科學(xué)，2016，36（2）：175-183.

[13]李晉華. 月月粉乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因RcAAT的克隆及功能分析[D]. 昆明：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[14]Nakamura S. Scent and component analysis of the Hybrid Tea Rose[J]. Perfume Flavor，1987，12：43-45.

[15]苗愛清，李家賢，何玉媚. 秀紅紅碎茶香氣的化學(xué)組成[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，1998（4）：25-27.黃小忠，謝春芹，張雪松，等. 蟬花真菌液體發(fā)酵及活性成分測(cè)定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（2）：197-201.