基于網絡藥理學探討金蕎麥治療慢性咽炎的作用機制

農達梅 左華江 吳春鳳

【摘 要】 目的：通過網絡藥理學方法探究金蕎麥治療慢性咽炎的有效成分、關鍵靶點、相關通路信息。方法：利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺TCMSP數據庫檢索，找出藥物金蕎麥的主要成分及作用靶點;利用人類基因組數據注釋系統（Gene Cards）和聯機孟德爾人類遺傳數據庫（OMIM）找出與疾病相關的作用靶點，將金蕎麥的主要成分的作用靶點與慢性咽炎的相關靶點取交集，將交集靶點導入STRING數據庫得到PPI網絡，對該網絡進行拓撲分析找出關鍵靶點，且通過Cytoscape3.7.0軟件構建“藥物-主要成分-疾病-作用靶點”網絡圖;把關鍵靶點導入DAVID數據庫，找出金蕎麥治療慢性咽炎關鍵靶點參與的生物學過程、分子功能、細胞組分和KEGG通路。結果：通過TCMSP數據庫的口服利用度（OB）和類藥性（DL）條件篩選出15個金蕎麥主要化合物，相應作用靶點100個;與慢性咽炎發病機制有關的作用靶點40個，經拓撲分析得到14個關鍵靶點;GO分析富集得到生物過程109個，分子功能30個，細胞組分9個，47條KEGG信號通路。結論：采用網絡藥理學的方法初步判斷金蕎麥治療慢性咽炎是多成分-多靶點-多通路實現的，可進一步揭示金蕎麥的藥用價值。

【關鍵詞】 網絡藥理學;慢性咽炎;有效成分;藥用價值

【中圖分類號】R285 ? 【文獻標志碼】 A ? ?【文章編號】1007-8517（2020）10-0044-07

Abstract：Objective To explore the information of active ingredients， key targets and related pathways of golden buckwheat in the treatment of chronic pharyngitis by network pharmacology. Methods The Chinese medicine system pharmacology database and analysis platform TCMSP database were used to find out the main components and target of the drug gold buckwheat; Using the Human Genome Data Annotation System （Gene Cards） and the Online Mendelian Human Genetic Database （OMIM） to find disease-related action targets， intersect the action targets of the main components of golden buckwheat with related targets of chronic pharyngitis， The intersection target is imported into the STRING database to obtain a PPI network， and the network is subjected to topology analysis to find key targets， and a “drug-main component-disease-acting target” network diagram is constructed by Cytoscape 3.7.0 software; The key targets were imported into the DAVID database， and the biological processes， molecular functions， cellular components， and KEGG pathways involved in the key targets of golden buckwheat for chronic pharyngitis were found.Results According to the oral availability （OB） and drug-like （DL） conditions of the TCMSP database，15 major buckwheat compounds were screened out， corresponding to 100 targets; 40 targets were related to the pathogenesis of chronic pharyngitis. Fourteen key targets were obtained by analysis; 109 biological processes， 30 molecular functions， 9 cellular components， and 47 KEGG signaling pathways were obtained by GO analysis and enrichment. Conclusion Using network pharmacology method to preliminarily judge that the treatment of chronic pharyngitis by golden buckwheat is realized by multi-component-multi-target-multi-path， which can further reveal the medicinal value of golden buckwheat.

Keywords：Network Pharmacology; Chronic Pharyngitis; Active Ingredients; Medicinal Value

咽炎在現代臨床醫學中作為一種常見的疾病。從相關病理和臨床癥狀上，可以將咽炎劃分為慢性類與急性類，其中慢性咽炎是咽黏膜和淋巴組織的慢性炎癥疾病[1]，經常也屬于人體上呼吸道感染的慢性炎癥的一些表現。慢性咽炎一些主要癥狀表現為咽干、咽疼、咽癢、異物感、燒灼感、微痛、惡心、影響睡眠及影響日常生活等[2]。長期患咽炎的大眾，不加以治療，嚴重影響人的生活質量。

金蕎麥（Fagopyrum dibotrys Hara）為蓼科蕎麥屬植物金蕎麥的根莖，其根莖為常用中藥材，是一種營養豐富并具有重要價值的藥資源植。金蕎麥別名野蕎麥、苦蕎頭、金鎖開銀等，在我國的四川、江西、江蘇等地都有分布。其性涼，味辛澀，歸肺經，具有清熱解毒、排膿祛瘀功效，常用于咽喉腫痛、肺熱咳嗽、乳蛾腫痛、頭風痛、消化不良、肝炎腹脹等病癥[3]。現代藥理學研究證實，金蕎麥有顯著的抗癌、抑制腫瘤細胞肺侵襲和轉移的作用，此外還具有消炎抗菌、抗衰老、抗氧化酶活性解熱抗炎、祛痰鎮咳、抗血小板聚集、抗突變、以抵抗自由基的降血糖、血脂作用以及提高免疫力等藥理作用[4-6]。趙炎軍[7]在研究中認為金蕎麥提取物具有一定的體外抗流感病毒作用。本研究利用網絡學藥理方法，從“藥物-化合物-作用靶點-疾病”復雜網狀結構探究金蕎麥治療慢性咽炎的關鍵作用靶點、分子生物學過程、信號通路等。以金蕎麥治療慢性咽炎的基礎研究提供參考思路。

1 方法

1.1 獲取金蕎麥主要化學成分及作用靶點 利用TCMSP（http：//tcmspw.com/）數據庫找出金蕎麥所有的化學成分，以口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18作為條件篩選主要有效成分，根據DrugBank數據庫獲取主要化學成分的預測靶點，并將化合物靶標蛋白逐一輸入String、UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）檢索以剔除重復、非人源的靶點，逐一轉化為主要活性化合物規范的靶點蛋白的基因標識符（Gene Symbol）。

1.2 篩選慢性咽炎的相關靶點及潛在作用靶點 Gene Cards數據庫克服了上百個數據庫自身格式的局限，整理歸納了基因表達、功能、位置、通路、變異、同源基因、疾病和相關參考文獻等各種信息，收集整理了上百個網站的內容，并將它們合理地系統地整合到一起。OMIM數據庫涵概關于人類遺傳病和基因座位等相關信息、和文獻的中心級數據庫。通過以上兩個數據，篩選了有關慢性咽炎的靶點1272個。將上述1.1藥物主要化學成分的預測靶點與疾病相關靶點導入Venney2.1分析平臺，取交集靶點，獲得潛在作用靶點。

1.3 金蕎麥化合物-疾病靶點及靶點互作網絡圖的構建 將篩選過后的主要化學成分與交集的潛在作用靶點輸入到Cytoscape3.7.0軟件，構建“藥物-主要成分-疾病-靶點”網絡，進行拓撲學分析。同時將篩選得到的共有靶點導入String平臺（http：//string-db.org），將Organism設定為“Homo aspiens”，最小交互分數取0.4，得到靶點互作的（PPI）網絡模型。由于STRING數據庫無法直觀的看出靶蛋白的Degree變化，故將STRING的蛋白互作信息保存為TSV格式并導入Cytoscape3.7.0軟件中采用Analyze network工具進行可視化分析，篩選出關鍵靶點。

1.4 關鍵靶點GO富集分析及相關信號通路注釋分析 為進一步了解上述篩選出的關鍵靶點的功能及相關信號通路的作用，將上述1.3的得到的關鍵靶點導入DAVID6.8數據平臺進行GO（Gene Ontology）生物學過程富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes Genomes）信號通路富集分析，設置靶基因名稱為人類進行篩選，將所有靶基因名稱校正為官方名稱（office gene symbol），通過設定閾值P<0.01，得到生物學過程、分子功能、細分和相關通路分析結果，并利用Origin7.5軟件將其結果可視化。

2 結果

2.1 金蕎麥主要化學成分的篩選、收集 通過TCMSP平臺數據庫檢索“金蕎麥”，總化合物為45種，以OB ≥30%，DL≥0.18為篩選條件選出15個潛在治療作用的活性化學成分，見表1。15個活性化合物共有100個作用靶點。

2.2 共有靶點的收取 將金蕎麥潛在活性化合物的作用靶點與Gene Cards數據庫及OMIM數據庫檢索出的慢性咽炎疾病靶點在Venney2.1平臺做韋恩圖，交集靶點40個，可認這40個靶點是金蕎麥治療慢性咽炎的主要靶點，如圖1。

2.3 PPI網絡圖構建 將金蕎麥治療慢性咽炎的40個主要靶點導入STRING數據庫，得到治療靶點的PPI網絡，通過Cytoscape進行可視化。由圖2可知，線條表示靶點與靶點之間相互作用關系。該網絡由260條邊組成一個完整的蛋白網絡互作圖。該圖中圓形的大小和顏色，從淺色圓形到深色橢圓形，形狀越來越大，顏色逐漸加深，表明Degree度值增大。PPI蛋白互作關系具體見表2（僅列出前20個靶點）。由表2可知，靶點平均Degree為13，Average Shortest Path Length（平均最短路徑長度）在1.3到2.8之間，網絡中節點的Closeness Centrality（連通度）、Betweenness Centrality（介數中心性）曲線接近于冪律分布，其中節點度值越大的節點，平均最短路徑長度越短的節點，表明該節點與慢性咽炎的相關性越大，治療慢性咽炎的可能性最大。超過靶點平均Degree的靶點有14個，可認為這14個靶點為關鍵靶點。

2.4 金蕎麥化合物-疾病靶點構建分析 從圖3可知，金蕎麥化合物-疾病靶點網絡共有57個節點，127條邊，包含了1種藥物、1種疾病、15個化合物、40個靶點，其中藍色棱形為藥物，紅色橢圓形為疾病，黃色長方形為化合物，綠色三角形為靶點。從度值大小上來看，排名前4位為quercetin（槲皮素）、luteolin（木犀草素）、β-sitosterol （β-谷甾醇）、isorhamnetin（異鼠李素），節點分別為34、17、8、5，這些化合物成分在治療慢性咽炎發揮著重要作用。

2.5 相關通路信息和注釋分析 為了進一步闡明金蕎麥活性成分的作用機制，將上述2.2預測得到的14關鍵靶蛋白導入DAVID數據平臺（https：//david.ncifcrf.gov）GO富集分析，得出148條目，其中包括生物學過程109條，分子功能30條，細胞組分9條，KEGG分析得到47條KEGG信號通路。經Bonferroni校正P<0.01，符合條件的有生物學過程為46條，分別為凋亡過程的負調控（negative regulation of apoptotic process）、藥物反應（response to drug）、上皮細胞增殖的陽性調節（positive regulation of epithelial cell proliferation）、細胞對白細胞介素-1的反應（cellular response to interleukin-1）、基因表達陽性調節（positive regulation of gene expression）等，見圖4。取P<0.01，符合條件的分子功能有15條，為酶綁定（enzyme binding）、蛋白質異二聚化活動（rotein heterodimerization activity）、轉錄激活子活性，RNA聚合酶II核心啟動子近端區序列特異性結合（transcriptional activator activity， RNA polymerase II core promoter proximal region sequence-specific binding）、轉錄因子綁定（transcription factor binding）等，見圖5。取P<0.01，符合條件的細胞組分有核質（nucleoplasm）、細胞質（cytoplasm）、核（nucleus）、膜（membrane）和膜筏（membrane raft），見圖6。取P<0.01得到31條信號通路，包括蛋白聚糖在癌癥（Proteoglycans in cancer）、通路在癌癥（Pathways in cancer）、膀胱癌（Bladder cancer）、小分子核糖核酸在癌癥（MicroRNAs in cancer）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）等，見圖7。大量的靶蛋白富集在這些注釋和信號通路上，通過-log（p）值顯現富集相關性大小，p越小，-log（p）值越大，則與疾病相關可能性越大。通過生物學過程、分子功能、細胞組分、相關信號通路來預測慢性咽炎，達到治療的目的。

3 討論

慢性咽炎（Chronic Pharyngitis）是一種咽喉部黏膜、黏膜下組織及淋巴組織產生的慢性炎癥，主要患病人群為青壯年。慢性咽炎治療起來病程較長，且癥狀容易反復發作[8]。根據流行病學顯示，我國慢性咽炎一直存在著較高的發病率，特別是在空氣質量較差的大城市，給眾多患者帶來煩惱和負擔，且較多的醫療資源用于治療咽炎。而引起咽炎的原因非常多，有慢性感染因素和非感染因素。前者為細菌類感染、菌群紊亂、鼻炎類;后者為職業性暴露、生活習慣及生活環境等[9]。慢性咽炎屬于傳統醫學“喉痹”范疇，在《素問·陰陽別論》[10]中提出咽喉者為陰陽升降之路，喉痹之病機主要是人體出現陰陽失衡。而中藥金蕎麥具有多成分、多靶點、多通路協同作用的特點，通過多途徑發揮直接或間接抗病菌、抗病毒治療慢性咽炎的作用。現市場上金蕎麥片聯合蓮花清瘟膠囊可起到緩解甲型H1N1流感、咽喉腫痛作用。金蕎麥也可作單味藥單獨使用，具有抗炎、祛痰鎮咳的功效，是治療慢性咽炎的有效藥物，但相關報道較少。

本研究通過篩選得到的15種活性成分，主要是黃酮類、甾體、有機酸等化學成分，其中最有意義的是黃酮類，為主要的藥理活性成分[11]。具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和提高機體免疫力等多種藥理學功效。從抗炎的角度探究，槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、異鼠李素對慢性咽炎的治療作用。劉濤等[12]在研究中表明了槲皮素、木犀草素對小鼠鎮痛、抗炎、鎮咳、祛痰的作用及對家兔的慢性咽炎治療作用。倪灣[13]闡述槲皮素的抗炎活性可通過NF-kB和Akt信號通路調節炎癥因子影響。研究發現，異鼠李素具有抗炎、抗病毒、抗氧化等作用，抗炎主要是通過抑制脂多糖（LPS）誘導的TNF-α，IL-1β和IL-6在體外和體內的分泌[14]。β-谷甾醇大多數存在于植物細胞膜中，其抗炎主要機制是對脂多糖誘導巨噬細胞，提高抗炎因子（IL-10）的活性[15]，β-谷甾醇臨床上常用于降低膽固醇。

金蕎麥治療慢性咽炎主要靶點為EGFR、CASP3、ESR1、MYC、IL6等14個。其中EGFR的變化代表慢性咽炎患者的病變水平，在孫恒[16]的研究中表明了血清EGFR的檢測在鼻咽癌患者臨床診治中的重要意義。CASP3作為半胱氨酸蛋白酶族的重要成員，可以通過細胞凋亡有序級聯反應[17]。MYC的過度表達是人類癌癥特征重要的一個特征，認為MYC癌基因通過轉錄因子，解除大量特定靶蛋白表達的調控，可以通過預測咽炎轉化為咽炎癌類型癌癥。

經過GO分析和KEGG分析發現，可以發現金蕎麥的有效化合物能作用于多個位點。如EGFR、CASP3、IL6、MCL1、RELA、 VEGFA、MDM2、MYC參與凋亡過程的負調控的生物學過程;PGR、EGFR、 CCND1、 HIF1A、ESR1、MDM2參與分子功能中酶綁定;PGR、CASP3、CCND1、HIF1A、MCL1、RELA、ESR1、MDM2、MYC參與細胞組分中核質的相關活動;EGFR、CASP3、CCND1、HIF1A、ERBB2、VEGFA、ESR1、MDM2、MYC靶蛋白涉及在蛋白聚糖在癌癥通路上。

綜上所述，網絡藥理學作為一種中藥研究的方法，研究了金蕎麥治療慢性咽炎的潛在作用機制，從而闡明了金蕎麥治療慢性咽炎有效成分與作用靶點及信號通路，并明確了金蕎麥通過多種活性成分、潛在作用靶點、各種生物學過程及信號通路發揮治療慢性咽炎的的作用機制，這為金蕎麥在慢性咽炎的治療中提供重要的參考價值。參考文獻

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（收稿日期：2020-02-18 編輯：劉斌）