HPLC法測定銀杏葉中黃酮的含量

劉力銘

摘 要：用高效液相色譜儀測定閬中市銀杏葉中黃酮的含量，黃酮甙由70%乙醇一水提取，并用鹽酸溶液水解。采用VP-ODSC8柱（150mm×4.6mm，5?m），流動相為甲醇：水（0.3%磷酸）=55：45體系，流速為1mL·min-1，檢驗波長為360nm，以槲皮素為標準品，在0.0050～0.1000g·L-1范圍內，成很好的線形關系，相關系數為0.9995，RSD為1.1%，結果表明：銀杏葉中總黃酮平均含量為0.1356%。

關鍵詞：高效液相色譜;黃酮;銀杏葉;水解

1前言

目前，銀杏葉中黃酮的提取方法有以下幾種：（1）水提取法（2）有機溶劑提取法（3）有機溶劑提取---樹脂凈化法（4）超臨界CO2提取法。由于除水提取法外其余幾種提取方法不是耗用大量的有機溶劑，操作復雜就是設備昂貴，不利推廣。因此，在本課題中，選用設備簡單，操作簡捷的水提取法。

2實驗部分

2.1主要儀器與試劑

主要材料：樂山市中區的銀杏葉

主要儀器：日本島津LC-2010AHT高效液相色譜儀;VP-ODS色譜柱（150mm×4.6mm，5?m）

提取裝置：帶回流管的圓底燒瓶

提取試劑：7O%（V/V）乙醇一水溶液250mL;取95%乙醇184mL加入66mL蒸餾水來配制

槲皮素標準溶液：0.2000g·L-1;稱取槲皮素對照品0.02000g于100mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度

二次亞沸蒸餾水無水乙醇甲醇均分析醇

2.2試驗方法

2.2.1標準工作曲線制作

移取槲皮素標準儲備液1.25，2.5，5.0，10.0，20.0mL，用無水甲醇定容至50mL容量瓶，進樣5μL，測定其峰面積。試驗結果表明，在0.0050～0.1000g·L-1范圍內，槲皮素的峰面積A與濃度C呈線性關系，回歸方程A=4X107×C-32642，相關系數為0.9995。

2.2.2樣品溶液的制備

將干燥（空氣濕度大時，可在80℃烘干0.5h）的銀杏葉研磨成粉末，稱取銀杏葉粉末5.0000g于圓底燒瓶中，加入70%乙醇一水溶液250mL浸泡12h以上，于50—550C的水浴中回流加熱5h提取黃酮甙，加HCl（25+75）20mL繼續在85℃下回流加熱1h，趁熱在鋪濾紙的瓷漏斗中抽濾，濾渣用乙醇沖洗，濾液及沖洗水轉移至500mL燒杯中緩慢濃縮，當濃縮到25mL時將其降溫，用無水甲醇定容于50mL容量瓶中。取適量于離心管中，離心10min，取其上清液，供分析用。

2.2.3色譜條件

VP-ODS色譜柱（150mmx4.6mm，5μm）;流動相為V（甲醇：V（0.3%磷酸）=55：45;流速為1mL·min-1;檢測器波長為360nm;進樣量為5μL;柱溫為3O0C。

2.2.4銀杏總黃酮含量計算

提取液經HPLC分析，測得樣品中主要成分為槲皮素、異鼠李素、山萘酚的峰面積A1，A2，A3。再根據槲皮素標準曲線、平均換算系數（2.51）及回歸方程，可得黃酮甙含量，計算公式如下：CT%=[（A1+A2+A3）×a+b]×2.51×50/mS×100%

a為槲皮素濃度與峰面積標準曲線斜率;b為槲皮素濃度與峰面積標準曲線截距;50為樣品溶液體積（mL）;ms為樣品質量（mg）。

3結果與討論

3.1流動相的選擇

從銀杏葉中提出的黃酮甙經水解后，含有槲皮素、山奈酚、異鼠素三種主要黃酮甙元以甲醇—磷酸水溶液（55：45）為流動相，三種成分可獲得滿意分離，加磷酸的原因可能是黃酮甙元中部分酚羥基電離成甙元陰離子造成，進而使組成的峰形拖尾，但在加入少量磷酸，則峰形明顯有所好轉。有些文獻中流動相中加入少量甲酸也取得很好的效果，但乙腈或四氫呋喃有機改性劑，不能改善山奈酚和異鼠李素的分離效果。

3.2檢測波長的選擇

在選定的流動相條件下，槲皮素、山奈酚、異鼠李素三種黃酮甙元的最大吸收波長略有差異，但在360nm處均有較強的吸收，為兼顧三者的靈敏度，選擇360nm為檢測波長。根據槲皮素的色譜圖1和文獻[1]以及所做的色譜圖可知三種黃酮甙元分離見圖2。

3.3實驗結果

根據2.2.4的計算方法計算出樂山市中區銀杏葉中總黃酮的含量為：

CT%=[（A1+A2+A3）×a+b]×2.51×50/mS×100%

將表1中的三種黃酮甙元的峰面積代入上面公式中得：

CT%=0.1356%（a為3×10-8b為0.001）

3.4分析方法檢驗

3.4.1精密度

在本實驗中，稱取干燥的銀杏葉粉末2g于四個圓底燒瓶中，用70的乙醇-水液進行提取，方法與2.2.2一樣，在加鹽酸時按比例加入8mI，最后濃縮，定容，分析。經HPLC分析得四次0.1605%，0.1543%，0.1572%，0.1557%，平均值為0.1569%相對標準偏差為1.1%。由此可見分析方法的重現性是比較好的。精密度主要由提取操作的重現性控制，尤其是抽濾和濾液與洗滌液轉移，操作時定量、熟練。

3.4.2重現性

按試驗方法平行測定試樣銀杏葉5次，測定總黃酮含量分別為0.1354%，0.1387%，0.1381%，0.1376%，0.1395%，由此可見分析方法的重現性是比較好的。

3.4.3提取效率

槲皮素是一種黃酮甙元，向樣品中加入槲皮素標準時不能使其與葡萄糖結合成黃酮甙，即加入的槲皮素仍以游離形式存在，因此，采用向樣品中加槲皮素的方法測定回收率，不能保證黃酮甙都是以能被所用提取體系提取出的形式存在，所測回收率不能保證其可靠性，只能檢驗在提取和水解過程中黃酮甙元的穩定性和方法的重現性。

參考文獻：

[1]張春秀，胡小玲，等，銀杏葉黃酮類化合物的提取分離[J].化學研究與運用，2001，13（4）：454

[2]程亞青，陶月良，張峰，等.雙波長吸光光度法測定植物中黃酮的含量[J].理化檢驗一化學分冊，2002，38