丹參通脈膠囊對大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究

徐濤　馬淑媛　周愛玲　孫付軍　王桂芝

【摘 要】 目的：觀察丹參通脈膠囊對大鼠腦缺血再灌注損傷（CIRI）的神經(jīng)保護(hù)作用，探討其可能的作用機(jī)制。方法：將80只雄性SD大鼠采用線栓法制備大腦中動脈栓塞（MCAO）模型，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、血塞通組、丹參通脈膠囊組，各20只，分別給予相應(yīng)的藥物，假手術(shù)組與模型組給予等體積生理鹽水，再灌注24h后對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損癥狀評分，計算腦梗死體積比;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測大鼠腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）的活性、丙二醛（MDA）的水平以及血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的含量。結(jié)果：丹參通脈膠囊能夠顯著改善腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分（P<0.01），顯著降低腦梗死體積比（P<0.01），提高腦組織中SOD活性（P<0.01），降低腦組織中MDA及血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量（P<0.01）。結(jié)論：丹參通脈膠囊對大鼠腦缺血再灌注損傷具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與減輕氧化應(yīng)激和抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 丹參通脈膠囊;腦缺血再灌注損傷;神經(jīng)保護(hù)作用;氧化應(yīng)激;炎癥反應(yīng)

【中圖分類號】R285.5?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2020）18-0030-05

Neuroprotective Effect and Mechanism of Danshen Tongmai Capsule on Cerebral Ischemia-reperfusion Injury in Rats

XU Tao1 MA Shuyuan2 ZHOU Ailing2 SUN Fujun3 WANG Guizhi4

1.Yiyuan County Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shandong Province，Yiyuan 2561002，China;

Jiaozhou peoples Hospital， handong Province，Jiaozhou 266300，China;

3.Shandong Institute of traditional Chinese medicine， Jinan 250014，China;

4.Dezhou Hospital of traditional Chinese medicine，Shandong Province，Dezhou 253013，China

Abstract：Objective To observe the neuroprotective effect of Danshen Tongmai capsule on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats and to explore its possible mechanism. Methods 80 male SD rats were randomly divided into sham operation group（n=20）， model group （n=20）， Xuesaitong group（n=20） and Danshen Tongmai capsule group （n=20）， given the corresponding drugs separately. The rats in sham operation group and model group were given the same volume of normal saline. 24 hours after reperfusion， the neurological deficit symptoms were scored and the volume ratio of cerebral infarction was calculated. The activity of superoxide dismutase and the level of malondialdehyde in brain tissue and the contents of tumor necrosis factor-α， interleukin-1 β and interleukin-6 in serum were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （Elisa）. [WTHZ]Results[WTBZ] Danshen Tongmai capsule could significantly improve the neurobehavioral score of cerebral ischemia-reperfusion rats， decrease the volume ratio of cerebral infarction， increase the activity of SOD in brain tissue， and decrease the contents of TNF- α， IL-1 β and IL-6 in brain tissue and serum.Conclusion Danshen Tongmai capsule has obvious neuroprotective effect on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats， and its mechanism may be related to reducing oxidative stress and inhibiting inflammation.

Keywords：

Danshen Tongmai Capsule;Cerebral Ischemia Reperfusion Injury;Neuroprotective Effect;Oxidative Stress;Inflammatory Reaction

缺血性腦血管病是由于多種因素導(dǎo)致的大腦血液循環(huán)障礙、腦組織受損而引發(fā)的局灶性神經(jīng)功能障礙，其發(fā)病率約占80%[1]。及時恢復(fù)大腦血液供應(yīng)可減輕神經(jīng)功能缺損癥狀。而CIRI是指一定時間內(nèi)在恢復(fù)血液供應(yīng)后，大腦功能不僅沒有得到改善，反而出現(xiàn)更加嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙及組織損傷[2]。氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)作為CIRI極其重要的病理機(jī)制受到了廣泛關(guān)注，大量研究結(jié)果證明氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)與CIRI具有密切聯(lián)系[3]，從而為CIRI的防治提供了具體的思路及方法，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)許多中藥單體活性成分對CIRI具有良好的改善作用，然而目前尚缺乏對于CIRI中藥復(fù)方制劑的研究。

丹參通脈膠囊由丹參、三七、水蛭、三酮（葛根黃酮、 銀杏葉黃酮、山楂葉黃酮）、牡丹皮、芍藥等藥物組成，具有行氣活血、祛瘀通絡(luò)之功效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，丹參通脈膠囊中的多種成分均具有抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)及神經(jīng)保護(hù)等作用，并且多次在大鼠MCAO模型中取得了較好的療效。丹參的甲醇提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，水溶性成分如丹酚酸B也能升高大鼠血清總SOD并且降低MDA的水平，丹參酮通過抑制TNF-α等多種炎性因子的mRNA和蛋白表達(dá)從而發(fā)揮抗炎活性[4]。朱會超等[5]發(fā)現(xiàn)三七總皂苷能明顯抑制巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL-6的表達(dá)，減輕再灌注腦損傷。該復(fù)方制劑中的其他成分在不同研究中均被證實(shí)具有不同程度的抗氧化、抗炎、抑制神經(jīng)元凋亡等作用。

本研究旨在揭示丹參通脈膠囊治療缺血性腦血管病的機(jī)理，探討丹參通脈膠囊對CIRI的神經(jīng)保護(hù)作用，并嘗試從氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)角度闡明其作用機(jī)制，為其進(jìn)一步在臨床中的使用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠80只，質(zhì)量320～350g，雌雄各半，由山東省動物中心提供，許可證號：SDCK20090001。自然光線下給予充足飲水和飲食，自由進(jìn)食水。

1.2 藥物 丹參通脈膠囊（山東省中醫(yī)藥研究所）;血塞通片（批號：200206193742，規(guī)格：50 mg/片，云南特安吶股份有限公司）。制備：實(shí)驗(yàn)前將丹參通脈膠囊制成52 mg/mL濃度的懸濁液，將血塞通片制成28 mg/mL等濃度懸濁液，4 ℃保存，備用。

1.3 試劑 2，3，5-氯化三苯基四氮唑、超氧化歧化酶（SOD）ELISA檢測試劑盒、丙二醛（MDA）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 儀器 酶標(biāo)儀（美國BD公司）;DDL-5低速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）;電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）。

2 方法

2.1 造模[6] 術(shù)前1周，大鼠自由飲水及進(jìn)食。稱重后將大鼠腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，仰臥固定，頸去毛消毒，于頸部正中開始切開并逐層分離，先分離右側(cè)頸總動脈，再分離頸內(nèi)動脈、頸外動脈，結(jié)扎右側(cè)頸總動脈近心端及其所有分支動脈，分離右側(cè)頸外動脈，并沿著頸外動脈結(jié)扎翼顎動脈，在頸外動脈近端備線，用動脈夾夾閉其遠(yuǎn)端，在頸總動脈分叉處做一切口，插入尼龍線，推進(jìn)時感阻力，表明栓線頭部到達(dá)大腦中動脈起始部，阻斷同側(cè)大腦中動脈所有血供來源，外留約長的1 cm線頭，縫合手術(shù)切口，完成一側(cè)造模。缺血2h后，輕拉線頭至有阻力，提示尼龍線頭部到達(dá)頸總動脈切口處，從而建立缺血再灌注模型。待大鼠蘇醒后評估神經(jīng)功能缺損，若出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損的癥狀則視為模型制作成功。假手術(shù)組大鼠除不插線外，其余步驟同上。

2.2 分組及給藥 將造模后的SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、血塞通組、丹參通脈膠囊組各20只。大鼠大腦中動脈再灌注手術(shù)缺血2 h后，給丹參通脈膠囊組大鼠進(jìn)行52 mg/mL濃度的懸濁液灌胃（1 mL/100 g）。血塞通組大鼠進(jìn)行28 mg/mL等濃度懸濁液灌胃（1 mL/100 g）。假手術(shù)組及模型組予等量生理鹽水灌胃。各組大鼠每日灌胃1次，共給藥14 d。

2.3 神經(jīng)功能評分 依據(jù)Longa等[7]5分制法對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分。評分方法如下：無神經(jīng)行為損傷癥狀計為0分;未能完全伸展對側(cè)前爪計為1分;向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈計為2分;向?qū)?cè)傾倒計為3分;不能自發(fā)行走，意識喪失計為4分。

2.4 大鼠腦梗死體積比測定 大鼠腦缺血再灌注24h后處死，開顱取腦，將視交叉向后的腦組織置于冰浴中切成一系列厚度3 mm的切片，置于TTC緩沖液中37 ℃避光染色30 min。用Image-ProPlus 6.0軟件處理圖片，計算各組腦梗死體積比。計算公式：腦梗死體積比=[（非缺血側(cè)半球面積-缺血側(cè)半球未梗死區(qū)面積）×厚度（3mm）/全腦體積]×100%。

2.5 腦組織中SOD、MDA的測定 腦組織中SOD、MDA采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行測定。大鼠處死后取大鼠缺血一側(cè)大腦額頂葉皮層組織，用生理鹽水制成10%勻漿后嚴(yán)格按照SOD、MDA檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度。

2.6 血清中炎癥因子的測定 大鼠腦缺血再灌注24h后處死，腹主動脈采血，分離血清，設(shè)置離心機(jī)條件為4 ℃、3500 r/min，離心15 min后，取上清液置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，按TNF-α、IL-1β、IL-6試劑盒說明進(jìn)行操作。酶標(biāo)儀測量各孔的吸光度。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料均以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或校正t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 丹參通脈膠囊對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評分的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的神經(jīng)功能評分明顯增高（P<0.01）;與模型組比較，丹參通脈膠囊組能使大鼠的神經(jīng)功能評分顯著降低（P<0.01）;與血塞通組比較，丹參通脈膠囊組對大鼠腦缺血再灌注引起的行為障礙改善效果更優(yōu)（P<0.01）。見表1。

3.2 丹參通脈膠囊對腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積比的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的腦梗死體積比明顯增高（P<0.01）;與模型組比較，丹參通脈膠囊組能使大鼠的腦梗死體積比顯著降低（P<0.01）;與血塞通組比較，丹參通脈膠囊組對大鼠腦梗死體積比降低效果更優(yōu)（P<0.05）。見表2。

3.3 丹參通脈膠囊對腦缺血再灌注大鼠腦組織中SOD、MDA的影響 與假手術(shù)組相比，模型組SOD活性顯著降低，MDA水平顯著升高（P<0.01）;與模型組相比，丹參通脈膠囊組SOD活性升高，MDA水平降低（P<0.01）;與血塞通組相比，丹參通脈膠囊組減輕大鼠腦缺血再灌注后的氧化應(yīng)激反應(yīng)作用更明顯（P<0.01）。見表3。

3.4 丹參通脈膠囊對腦缺血再灌注大鼠血清中炎癥因子的影響 與假手術(shù)組相比，模型組的TNF-α、IL-1β、IL-6的含量均顯著升高（P<0.01）。與模型組相比，丹參通脈膠囊組TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著降低（P<0.01）;與血塞通組比較，丹參通脈膠囊組對炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的抑制作用更明顯。見表4。

4 討論

缺血性腦血管病是嚴(yán)重威脅人類健康的一種高發(fā)病率、高致殘率及高死亡率的重大疾病，治療該病的主要目標(biāo)是盡早恢復(fù)腦組織供血從而減輕腦組織損傷及改善神經(jīng)功能，然而再灌注后對大腦產(chǎn)生的二次損傷成為目前研究的難點(diǎn)及熱點(diǎn)。腦缺血再灌注損傷機(jī)制十分復(fù)雜，可引起一系列細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)分子及其調(diào)節(jié)過程的變化，主要包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、興奮性氨基酸毒性、血腦屏障破壞等病理過程[8-9]。

大鼠因具有與人類相似的腦血管解剖結(jié)構(gòu)、功能等特點(diǎn)，因此常被用于復(fù)制腦缺血的實(shí)驗(yàn)動物模型[10]。線栓法制備的MCAO模型是目前所公認(rèn)的缺血性腦卒中的理想模型，該模型為缺血性腦損傷的實(shí)驗(yàn)研究提供了條件[11]。用于MCAO模型的評價方法多種多樣，如神經(jīng)功能評分、TTC染色、腦組織含水量、局部腦血流測定等。腦梗死體積測定能夠直觀地了解大鼠腦缺血情況，且實(shí)驗(yàn)步驟簡單易行，是MCAO模型較常用的評價方法。而神經(jīng)功能評分法無需借助特殊儀器設(shè)備，具有直觀、簡便的優(yōu)點(diǎn)，可以從整體角度觀察動物神經(jīng)損傷程度[12]，因此本研究采用神經(jīng)功能評分與腦梗死體積比評價相結(jié)合的方式觀察丹參通脈膠囊對大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。研究成功構(gòu)建了腦缺血再灌注模型大鼠，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用丹參通脈膠囊進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示丹參通脈膠囊可以提高腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評分，減少大鼠腦組織的壞死，提示其可以保護(hù)腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能，減少損傷區(qū)域。

由于腦組織代謝旺盛、需氧量高，導(dǎo)致較多的活性氧（Reactive Oxygen Species， ROS）生成。正常生理情況下，ROS的生成與清除處于動態(tài)平衡，在腦缺血再灌注損傷的病理過程中，過量的ROS引起脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞內(nèi)鈣超載負(fù)荷等一系列反應(yīng)從而直接導(dǎo)致細(xì)胞壞死，也可以通過激活多種途徑（如線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑、膜受體途徑或DNA修復(fù)酶途徑等）引起神經(jīng)元凋亡等過程[13-14]。SOD是體內(nèi)最重要且最有效的抗氧化酶之一，可清除過量的氧自由基，維持機(jī)體代謝平衡，SOD活性間接反映了體內(nèi)抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及清除氧自由基的能力。ROS作用于生物膜上不飽和脂肪酸形成過氧化脂質(zhì)，該產(chǎn)物進(jìn)一步降解形成毒性產(chǎn)物-醛類，造成膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞，MDA即脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物之一，其水平的高低可反映腦組織中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度，間接反映了細(xì)胞的損傷情況[15]。本研究結(jié)果顯示腦缺血再灌注大鼠模型中SOD活性下降而MDA水平升高，提示再灌注后大量氧自由基的生成消耗了SOD的儲備，脂質(zhì)過氧化加劇從而導(dǎo)致MDA升高，丹參通脈膠囊明顯增強(qiáng)了腦組織中SOD的活性并且降低了MDA的含量，證明其對減輕再灌注后的氧化應(yīng)激具有一定的作用。

腦缺血再灌注后大量浸潤的炎性細(xì)胞因子引起級聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)是造成腦損傷的重要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，炎性細(xì)胞因子可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促使趨化因子、粘附分子和E/P-選擇素的表達(dá)增加，破壞血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能并促進(jìn)腦組織水腫的形成。此外，炎性細(xì)胞因子還能通過增強(qiáng)花生四烯酸的代謝來增加自由基的釋放進(jìn)而加重氧化應(yīng)激損傷[16]。TNF-α 是由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞分泌的一種促炎因子，在腦缺血發(fā)生時炎性相關(guān)細(xì)胞過度表達(dá)使其分泌增加，TNF-α可進(jìn)一步激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，分泌大量 IL-1β等炎癥因子，引起一系列的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，從而加重腦組織損傷[17-18]。IL-1β是一種炎癥細(xì)胞的強(qiáng)烈趨化因子， 能誘導(dǎo)和促進(jìn)腦缺血后炎癥介質(zhì)的損傷作用[9]。IL-6在大腦中主要由小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，是關(guān)鍵的炎性細(xì)胞因子之一，參與炎癥調(diào)節(jié)和免疫反應(yīng)，能夠誘導(dǎo)其他炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生并且協(xié)同其他炎性細(xì)胞因子促進(jìn)B/T細(xì)胞活化，加重腦組織損傷[19]。故腦缺血再灌注損傷越嚴(yán)重，體內(nèi)炎癥反應(yīng)越劇烈，這三種炎癥因子也會出現(xiàn)相應(yīng)的升高。本次研究發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β、IL-6在腦缺血再灌注大鼠模型的血清中均有升高，給予丹參通脈膠囊后上述三種炎癥因子均有不同程度的降低，提示丹參通脈膠囊可有效減輕腦缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)。

缺血性腦血管病大體屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”病范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為陰陽失調(diào)，氣血逆亂是其基本病機(jī)，病理性質(zhì)應(yīng)屬本虛標(biāo)實(shí)，本虛多為陰精、氣血虧虛，標(biāo)實(shí)多為痰瘀內(nèi)阻于腦。然而根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于其病因的認(rèn)識可以推斷痰瘀阻絡(luò)在“中風(fēng)”病的發(fā)生發(fā)展中起著極其重要的作用，腦缺血再灌注損傷則類似于中醫(yī)學(xué)中氣血津液運(yùn)行不暢，痰瘀漸而變生濁毒損傷腦竅的病理過程，治宜行氣活血、祛瘀通絡(luò)。丹參通脈膠囊以中醫(yī)理論基礎(chǔ)為指導(dǎo)，活血而不耗氣，通絡(luò)而不傷正，兼顧涼血清熱，組方精準(zhǔn)，功效顯著。

綜上所述，丹參通脈膠囊能夠明顯改善腦缺血再灌注大鼠行為學(xué)評分，對于腦缺血再灌注具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，其發(fā)揮作用的機(jī)制可能與減輕氧化應(yīng)激及抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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（收稿日期：2020-05-04 編輯：劉斌）

基金項目：山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目（編號：2017-483）。

作者簡介：徐濤（1975- ），男，漢族，本科，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合心腦血管病、脾胃病研究。E-mail：xutao1975@163.com

通信作者：馬淑媛（1974- ），女，漢族，本科，主管醫(yī)師，研究方向?yàn)樾哪X血管病的防治工作。E-mail：Mmxy1974@163.com