黃芩苷對異丙腎上腺素誘導心力衰竭大鼠心室重構及心室肌凋亡、纖維化的影響

王智 王娟 趙東明

[摘要]目的：探討黃芩苷對異丙腎上腺素誘導心力衰竭大鼠心室重構及心室肌凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、纖維化的影響。方法：將40只清潔級雄性Wistar大鼠分為對照組、黃芩苷低、中、高劑量組及卡托普利組，各8只，共干預28d;多普勒超聲檢測大鼠LVEF%、LVPWd及LVEDd變化;ELISA法檢測血清中NTpro-BNP及ST水平，采用TUNEL及Masson染色檢測心室肌細胞凋亡及纖維化情況;Westernblot法檢測心室肌組織中GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1、Smad7蛋白表達。結果：與對照組比較，模型組LVEF%、LVPWd降低，LVIDd升高，血清ST2、NT-proBNP水平及心室肌細胞中AI值、CVF、GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1表達升高，Smad7表達降低（P<0.001）;與模型組比較，黃芩苷低、中、高劑量組及卡托普利組心室重構改善，血清T2、NT-proBNP水平及心室肌細胞中AI值、CVF、GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1表達降低，Smad7表達升高，且呈劑量依賴性（P<0.001）。結論：黃芩苷可能通過抑制ERS及TGF-β1/Smad7信號通路，起到減少心肌細胞凋亡，抑制心肌纖維化，從而起到逆轉心室重構，改善心力衰竭的作用。

[關鍵詞]黃芩苷;心力衰竭;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激;凋亡;纖維化

[中圖分類號]R542.23;R363.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]2096-5249（2021）17-0011-02

黃芩在中藥歸類中，歸屬清熱瀉火類藥物，但近年來大量研究證實，黃芩中的有效提取物——黃芩苷對多種原因造成的心肌細胞損傷有明確效果[1-2]。異丙腎上腺素（ISO）是制備心力衰竭大鼠模型的經(jīng)典藥物，通過激動β受體，促使心率加快，使心臟長期處于相對缺血環(huán)境，最終引發(fā)心力衰竭[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（ERS）本為真核細胞的一種自我保護機制，可降解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊蛋白，而長期或強度過高的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激使細胞自身難以將錯誤折疊蛋白全部降解，最終導致細胞凋亡，而抑制ERS，減少心肌細胞凋亡數(shù)量也是目前心力衰竭的研究熱點和新方向[4]。本研究通過ISO建立心力衰竭大鼠模型，應用不同劑量黃芩苷進行干預，觀察心力衰竭大鼠心室重構、心肌細胞凋亡、ERS及纖維化發(fā)生情況。

1材料與方法

1.1實驗藥品及試劑黃芩苷（江北藥業(yè)，純度≥98%）;TUNEL試劑盒（翊圣生物科技有限公司）;ST2、BNP試劑盒（北京六一公司）;GRP78、IRE1、CHOP、山羊抗兔二抗單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）。5180/R型離心機（德國Eppendorf公司）;WD-9413B型凝膠成像系統(tǒng)（北京六一公司）;ChemDocXRS型化學發(fā)光成像儀（美國Bio-red公司）。MK3型酶標儀（美國Multiskan公司）;GEVividE9彩色超聲（美國GE公司）。

1.2心力衰竭模型大鼠制備與分組40只清潔級雄性Wistar大鼠，體重（200±15）g，隨機分為對照組、模型組、黃芩苷低、中、高劑量組卡托普利組，每組各8只。對照組外，其余大鼠均根據(jù)文獻[5]制備心力衰竭模。黃芩苷組低、中、高劑量組分別給予黃芩苷25、50、100mg/kg·d灌胃，卡托普利組給予卡托普利50mg/kg·d灌胃[6]，對照組每天給予等體積生理鹽水灌胃，每組均連續(xù)給藥28d。

1.3多普勒心臟超聲檢測于實驗第28d將大鼠麻醉，脫毛膏退去胸前毛發(fā)，應用皮膚探頭對大鼠進行心功能檢測，記錄并比較各組大鼠LVEF%、LVPWd及LVEDd情況。

1.4血清ST2、NT-proBNP水平檢測各組大鼠進行腹主動脈抽血，并處死，2000r/min條件下分離血清，采用ELISA法對ST2、NT-proBNP進行檢測，嚴照說明書操作。

1.5TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡情況處死大鼠后使用眼科剪子取心室部分組織，經(jīng)脫水、固定、TUNEL染色后放入恒溫箱進行孵育，沖洗3次后進行封片。應用光學顯微鏡觀察鏡下凋亡細胞，褐色代表已凋亡細胞，藍色代表仍生存細胞，于200倍鏡下觀察各組大鼠心室肌細胞凋亡情況，凋亡指數(shù)（AI）=各視野陽性細胞數(shù)/視野所有細胞總數(shù)×100%，實驗獨立重復3次。

1.6Masson染色將各組大鼠心室肌組織投入至固定液中，經(jīng)脫水、固定后，置于切片機中連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟、二甲苯透明后進行Masson染色。染色后用ImageJ5.0圖像分析軟件鏡下組織膠原容積分數(shù)（CVF）分析進行統(tǒng)計，實驗獨立重復3次。

1.7Westernblot法檢測ERS及纖維化信號通路蛋白將大鼠部分心室加入液氮，冷研磨后制備10%組織勻漿，根據(jù)文獻[7]進行操作，GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1、Smad7單克隆抗體比例分別為1：800、1：1000、1：800、1：1000、1：1000，后經(jīng)暗室曝光，掃描膠片，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析，實驗獨立重復3次。

1.7統(tǒng)計學處理采用SPSS20.0軟件，計量資料以x±s表示，多組間比較數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1多普勒超聲結果超聲結果顯示，模型組較對照組LVEF%、LVPWd降低，LVIDd升高（t=-11.16，t=-12.76，t=24.58，均P<0.001）;黃芩苷低、中、高劑量組及卡托普利組較模型組LVEF%、LVPWd升高，LVIDd降低;且隨黃芩苷劑量升高上述指標改善趨勢更加明顯（P<0.001），詳見表1。

2.2血清ST2、NT-proBNP檢測結果結果顯示，模型組較對照組ST2、NT-proBNP水平升高（t=8.8，t=21.3，P<0.001）;黃芩苷低、中、高劑量組及卡托普利組較模型組ST2、NT-proBNP水平降低，且隨黃芩苷劑量升高而降低（P<0.001），詳見表2。

2.3TUNEL染色結果結果顯示，模型組（8.49±3.97）較對照組（3.66±0.19）AI值升高（P<0.001）;黃芩苷低（29.87±5.69）、中（25.4±2.66）、高劑量組（15.13±1.55）及卡托普利組（15.47±0.76）較模型組AI值降低，且隨黃芩苷劑量升高而降低（F=94.36，P<0.001）。

2.4Masson染色結果結果顯示，模型組（26.47±1.82）較對照組（2.37±0.49）CVF升高（t=22.15，P<0.001）;黃芩苷低（18.57±1.93）、中（12.37±1.43）、高劑量組（7.23±0.91）及卡托普利組（7.2±0.85）較模型組CVF降低，且隨劑量的升高而降低（F=74.66，P<0.001）。

2.5ERS信號通路蛋白檢測結果結果顯示，模型組大鼠心室肌組織中GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1表達較對照組升高，Smad7較對照組降低（t=6.19，t=14.82，t=24.98，t=17.44，t=-15.14，均P<0.001）;黃芩苷低、中、高劑量組及卡托普利組較模型組GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1表達降低，Smad7表達升高;且隨黃芩苷劑量升高改變趨勢越加明顯（P<0.001），詳見圖1、表3。

3討論

心肌纖維化和心肌細胞凋亡是導致心室重構的重要原因，而心室重構又是心力衰竭的病理基礎，因此，抑制心肌細胞凋亡及纖維化是逆轉心室重構，改善心力衰竭的新方向[8-9]。黃芩苷對不同心血管疾病的作用已在心血管領域成為研究熱門，有潛質(zhì)成為治療或輔助治療多種心血管疾病的有效藥物[10]。

本團隊在前期研究中證實[2]，黃芩苷可通過抑制線粒體凋亡信號通路，降低膿毒血癥損傷心肌細胞的凋亡數(shù)量。黃芩苷對于ISO誘發(fā)心力衰竭心肌保護作用鮮有報道，本團隊通過，頸部后皮下注射ISO進行心力衰竭模型大鼠造模，進而采用不同濃度黃芩苷進行干預，并使用卡托普利作為陽性對照藥物，觀察黃芩苷對心力衰竭大鼠心室重構、心肌細胞凋亡、纖維化的作用。結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度黃芩苷干預治療后，大鼠LVEF%、LVPWd升高，LVIDd降低，且血清中心衰標物ST2、NTpro-BNP均降低，且隨劑量增高改善趨勢愈加明顯，從形態(tài)學與血清標記物角度說明心力衰竭模型大鼠心室重構在一定程度上被逆轉，心力衰竭有所改善，存在劑量依賴性。TUNEL及Masson染色實驗結果證實，心力衰竭模型大鼠

心室肌組織存在較為嚴重的纖維化和細胞凋亡，而經(jīng)黃芩苷干預治療后，心室肌組織AI值及CVF均降低，且隨劑量的增加而降低，說明黃芩苷逆轉心室重構可能是通過抑制心肌細胞凋亡和抑制纖維化實現(xiàn)的。

目前，研究已證實持續(xù)而強烈的ERS是引起的ISO心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡的重要因素[11]。TGF-β1是目前已知的能導致大部分器官發(fā)生纖維化的細胞因子，其可能通過過表達Smads相關蛋白加重組織或器官纖維化，而Smads7是Smads家族蛋白的抑制受體，當Smads7低表達時，則可能導致纖維化的發(fā)生[12]。為了探究黃芩苷抑制心肌細胞凋亡和纖維化的深層機制，本團隊對心室肌組織ERS和TGF-β1/Smads7纖維化信號通過進行檢測。結果證實，心力衰竭大鼠心室肌組織GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1呈高表達，Smad7呈低表達，說明心力衰竭大鼠心室肌組織存在ERS引起的凋亡和TGF-β1/Smads7引起的纖維化。而經(jīng)黃芩苷干預治療后，GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1表達降低，Smad7表達升高，且黃芩苷劑量升高改變趨勢越加明顯，說明黃芩苷可能通過阻斷ERS和TGF-β1/Smads7信號通路，起到抑制心室肌細胞凋亡及纖維化作用，進而逆轉心室重構，改善心力衰竭的作用。

綜上所述，黃芩苷可能通過抑制GRP78/IRE1/CHOP及TGF-β1/Smad7信號通路，起到減少心肌細胞ERS凋亡，抑制心肌纖維化，從而起到逆轉心室重構，改善心力衰竭的作用。

參考文獻

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基金項目：吉林省中醫(yī)藥科技普通資助項目（編號：2019126）

*通信作者：王智（1983-），男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：冠心病發(fā)病機制及藥物治療研究。

（收稿日期：2021-3-11 接受日期：2021-4-27）