左氧氟沙星片微生物限度方法學(xué)研究

余曉謙 陳怡

摘要：為了建立左氧氟沙星片微生物限度檢查方法，采用中和法加薄膜過濾法對左氧氟沙星片微生物限度方法學(xué)，

關(guān)鍵詞：左氧氟沙星 微生物限度 中和法 薄膜過濾法

【中圖分類號】R97 ?【文獻標(biāo)識碼】A ?【文章編號】1673-9026（2021）09-355-02

目前，隨著左氧氟沙星片在市場上運用越來越廣泛，但是未見左氧氟沙星片微生物限度方法的文獻報道。根據(jù)中國藥典 2020年版[2]微生物限度相關(guān)規(guī)定，進行了左氧氟沙星片微生物限度方法學(xué)驗證。由于左氧氟沙星片為抗生素的一種，是喹諾酮類抗生素，因此選用硫酸鎂中和劑，本品采用2020年版四部《中國藥典》微生物限度計數(shù)法檢查中的中和法+薄膜過濾法。

一、材料

1、儀器與用具：立式壓力蒸汽滅菌器（LDZF-30、LDZM-60KCS-Ⅱ）、凈化工作臺（SW-CJ-1FD）、霉菌培養(yǎng)箱（MJ-250）、生化培養(yǎng)箱（SHP-150）、生化培養(yǎng)箱（SH-250）

2、稀釋劑：硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鎂

3、培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號：181119）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號190102：）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號20180122：）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號：20180302）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號：181211）、麥康凱液體培養(yǎng)基（批號：1082781）。

4、實驗用菌種：銅綠假單胞菌（CMCC（B）10104）、枯草芽孢桿菌（CMCC（B）63501）、金黃色葡萄球菌（CMCC（B）26003）、白色念珠菌（CMCC（F）98001）、黑曲霉菌（CMCC（F）98003）、大腸埃希菌（CMCC（B）44102）。

二、方法

1、菌液制備：

①取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24小時的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的新鮮胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物1ml，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%氯化鈉溶液制成菌數(shù)不大于100cfu的菌懸液;做活菌計數(shù)備用。

②取經(jīng)20℃～25℃培養(yǎng)2～3天的白色念珠菌液體培養(yǎng)物1ml，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%氯化鈉溶液制成菌數(shù)不大于100cfu的菌懸液，做活菌計數(shù)備用。

③接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面中，經(jīng)20℃～25℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%氯化鈉溶液，洗下霉菌孢子，用帶有棉花的球形吸管取出菌液至無菌試管內(nèi)，將孢子懸液稀釋制成含孢子數(shù)不大于100cfu的菌懸液，做活菌計數(shù)備用。

2、供試品制備

取本品10g，用0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液加至100ml，充分震蕩，搖勻，制成1：10供試液。靜置片刻，取1：10上清液適量，用0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液稀釋制成1：20和1：100的供試液

三、驗證方法

3.1計數(shù)方法適用性驗證

3.1.1試驗組：分別取1：100的供試品溶液各1ml，加至500ml稀釋劑中混勻，采用薄膜過濾法，以0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液沖洗5次，每次沖洗量為100 ml，在最后一次沖洗液中加入試驗菌。試驗菌共5組，分別是金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液，過濾后取出濾膜，菌面朝上，分別貼于胰酪大豆胨瓊脂平皿中于30～35℃培養(yǎng)，各制備兩個平行皿，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3組培養(yǎng)3天，白色念珠菌、黑曲霉菌2組培養(yǎng)5天，逐日觀察結(jié)果，計數(shù)。

3.1.2菌液組：分別取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液，測定每一菌株的加入試驗菌數(shù)。

3.1.3供試品對照組：取制備好的供試液，用稀釋液代替菌液同試驗組操作，每種培養(yǎng)基平行制備2個平皿。

3.1.4陰性對照組：用不含中和劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液，進行陰性對照組試驗，每種培養(yǎng)基平行制備2個平皿。

3.1.5中和劑對照組：用含中和劑的稀釋液分別測定金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液每一菌株的加入試驗菌數(shù)。

3.2霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法驗證

3.2.1試驗組：取1：20、1：50、1：100的供試品溶液各1ml加至500ml的稀釋液中，搖勻，薄膜過濾，每張膜用稀釋液500ml分次沖洗，在最后一次沖洗液中加入1ml試驗菌， 試驗菌共2組，分別是白色念珠菌、黑曲霉菌，過濾后取出濾膜，菌面朝上，將濾膜貼于相應(yīng)的沙氏葡萄糖瓊脂平皿，于20～25℃培養(yǎng)，分別各制備2個平皿，培養(yǎng)5天，逐日觀察結(jié)果，計數(shù)。

3.2.2菌液組：分別取白色念珠菌、黑曲霉菌液，測定每一菌株的加入試驗菌數(shù)。

3.2.3供試品對照組：取制備好的的供試品溶液，以稀釋液代替菌液同試驗組操作，每種培養(yǎng)基平行制備2個平皿。

3.2.4陰性對照組：用不含中和劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液，進行陰性對照組試驗，每種培養(yǎng)基平行制備2個平皿。

3.2.5中和劑對照組：以含中和劑的稀釋液分別測定白色念珠菌、黑曲霉菌液每一菌株的加入試驗菌數(shù)。

3.3控制菌大腸埃希菌檢查適用性驗證

3.3.1方案①

3.3.1.1試驗組：取1：10的供試品溶液適量稀釋成1：20和1：40的供試品溶液，取1：20的供試品溶液20ml和1：40的供試品溶液40ml分別加入500ml的0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液中，搖勻，薄膜過濾，以0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液沖洗10次，每次沖洗量為100 ml，在最后一次沖洗液中加入1ml不大于100cfu/ml大腸埃希菌，濾干后取濾膜分別加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中;

3.3.1.2中和劑對照組：同試驗組操作，不加任何溶液以0.1mol/L硫酸鎂的%0.9氯化鈉溶液沖洗濾膜10次，每次沖洗量為100 ml，濾干后取濾膜加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中;

3.3.1.3陽性對照組：取1ml不大于100cfu/ml大腸埃希菌，不加任何供試液，同試驗組操作。

3.3.1.4供試品組：取1：20和1：40的供試品溶液20ml和40ml分別加入500ml的0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液中，搖勻，薄膜過濾，以0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液沖洗10次，每次沖洗量為100 ml，濾干后取濾膜分別加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。

3.3.2方案②

3.3.2.1試驗組：取1：10的供試品溶液適量稀釋成1：40，再取1：40的供試品溶液40ml加入500ml的0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液中，搖勻，薄膜過濾，以0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液沖洗10次，每次沖洗量為100 ml，在最后一次沖洗液中加入1ml不大于100cfu/ml大腸埃希菌，濾干后取濾膜和40ml0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液加入400ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中;

3.3.2.2中和劑對照組：取0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液40ml薄膜過濾，同試驗組操作，以0.1mol/L硫酸鎂的%0.9氯化鈉溶液沖洗10次，每次沖洗量為100 ml，濾干后取濾膜和0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液40ml加入400ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中;

3.3.2.3陽性對照組：取1ml不大于100cfu/ml大腸埃希菌，不加任何供試液，同試驗組操作。

3.3.2.4供試品組：取1：40的供試品溶液40ml加至500ml的0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液中，搖勻，薄膜過濾，以0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液沖洗10次，每次沖洗量為100 ml，濾干后取濾膜和0.1mol/L硫酸鎂的0.9%氯化鈉溶液40ml加入400ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中;

置于溫度30℃～35℃培養(yǎng)18～24小時后，觀察結(jié)果，結(jié)果見附件三表2和表3。取1ml培養(yǎng)物接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基，于溫度42℃～44℃培養(yǎng)24～48小時，觀察結(jié)果。

3.4.4.2取上述麥康凱液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，于30℃～35℃培養(yǎng)18～72小時，觀察結(jié)果。

四結(jié)果

4.1計數(shù)方法適用性驗證

采用中和法+薄膜過濾法，沖洗量為500ml，試驗組菌落數(shù)均值減去供試品對照組菌落數(shù)均值與菌液對照組菌落數(shù)均值的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi);中和劑對照組菌落數(shù)均值與菌液對照組菌落數(shù)均值的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)。該方法適用于左氧氟沙星片需氧菌檢查。

采用中和法+薄膜過濾法，沖洗量為500ml，試驗組菌落數(shù)均值減去供試品對照組菌落數(shù)均值與菌液對照組菌落數(shù)均值的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi);中和劑對照組菌落數(shù)均值與菌液對照組菌落數(shù)均值的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)。若各試驗菌的回收比值均符合要求，照所用的供試液制備方法及計數(shù)方法進行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法的驗證。

采用中和法+薄膜過濾法，沖洗量為1000ml，試驗組：結(jié)果為陽性檢出大腸埃希菌;陽性組：結(jié)果為陽性檢出大腸埃希菌，中和劑對照組：結(jié)果為陰性未檢出大腸埃希菌;供試品組：結(jié)果為陰性未檢出大腸埃希菌。若試驗組檢出試驗菌，則照所用的供試液制備方法及控制菌檢查方法進行供試品控制菌檢查方法的驗證。

左氧氟沙星片微生物限度檢查方法適用性試驗驗證過程中，各項目都合格。左氧氟沙星片微生物限度檢查方法適用性試驗驗證方法進行。左氧氟沙星片微生物限度檢查方法適用性試驗證過程中，各項目測試進行順利，結(jié)果均符合預(yù)期。

參考文獻：

[1]唐映紅，伍參榮，魏云，吉蘭.鹽酸左氧氟沙星體內(nèi)外抗菌作用研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2007，26（9）：983-986.