阿魏酸對間充質干細胞增殖、分泌 干細胞因子和成管分化的影響

肖慧 彭林娟 熊武 白雪 譚梅鑫 李葉蘭 楊瑩 朱晨鴻 鄒曉玲

〔摘要〕 目的 探討阿魏酸（ferulic acid， FA）對間充質干細胞（mesenchymal stem cells， MSCs）增殖、分泌干細胞因子（stem cell factor， SCF）和定向內皮細胞成管分化的影響。方法 取足月健康新生兒臍帶血10 mL，采用密度梯度離心法得到單個細胞，并鑒定人臍帶血間充質干細胞（human umbilical cord blood mesenchymal stem cells， hUCBMSCs）分化能力。將hUCBMSCs分別用不同濃度梯度的FA（0、1、2、4、8、16 mg/L）干預以確定FA促hUCBMSCs增殖的最佳濃度。取hUCBMSCs隨機分為實驗組與對照組，實驗組用最佳濃度FA干預，對照組用等體積PBS液處理。分別采用CCK-8細胞增殖試驗、Matrigel體外成管試驗及ELISA法檢測兩組hUCBMSCs增殖、成管及分泌SCF的能力;采用免疫熒光法檢測hUCBMSCs向內皮細胞分化后CD31、vWF的表達情況。結果 （1）hUCBMSCs能成功誘導分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞;（2）FA促進hUCBMSCs增殖的最佳濃度為2 mg/L;（3）與對照組相比，實驗組hUCBMSCs增殖、成管及分泌SCF能力顯著增強，且FA誘導成管分化后CD31和vWF的表達明顯增多（P<0.05）。結論 FA能促進hUCBMSCs增殖及分泌SCF，同時能誘導hUCBMSCs成管分化，進一步證實FA具有促進血管新生的潛能。

〔關鍵詞〕 阿魏酸;間充質干細胞;細胞增殖;干細胞因子;成管分化;血管新生

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.08.005

Effects of Ferulic Acid on the Proliferation， Stem Cell Factor Secretion and Tube

Differentiation of Mesenchymal Stem Cells

XIAO Hui1， PENG Linjuan1， XIONG Wu2， BAI Xue1， TAN Meixin1， LI Yelan1， YANG Ying1， ZHU Chenhong1， ZOU Xiaoling2*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective To study the effects of ferulic acid （FA） on the proliferation， the secretion of stem cell factor （SCF） and the differentiation of targeted endothelial cells by mesenchymal stem cells （MSCs）. Methods Single nuclear cells were isolated by density gradient centrifugation from cord blood of full-term healthy newborns， and the differentiation ability of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells （hUCBMSCs） were identified. hUCBMSCs were intervened with FA with different concentration gradients （0， 1， 2， 4， 8， 16 mg/L） to determine the optimal concentration of FA to promote the proliferation of hUCBMSCs. hUCBMSCs were randomly divided into the experimental group and the control group. The experimental group was intervened with the best concentration of FA， the control group was treated with PBS solution of equal volume. CCK-8 cell proliferation test， Matrigel in vitro tube test and ELISA method were used to detect the proliferation， tube formation and SCF secretion ability of the two groups of hUCBMSCs; immunofluorescence method was used to detect the expression of CD31 and vWF after hUCBMSCs differentiated into endothelial cells. Results （1） hUCBMSCs can successfully induce differentiation into bone cells， chondrocytes and adipocytes. （2） The optimal concentration of FA to promote the proliferation of hUCBMSCs is 2 mg/L. （3） Compared with the control group， the ability of hUCBMSCs in the experimental group to proliferate， form tubes and secrete SCF was significantly enhanced， and the expression of CD31 and vWF increased significantly after FA induced tube differentiation （P<0.05）. Conclusion FA can promote the proliferation， the secretion of SCF from hUCBMSCs， and induce the differentiation of hUCBMSCs into tubes， further confirming that FA has the potential to promote angiogenesis.

〔Keywords〕 ferulic acid; mesenchymal stem cell; cell proliferation; stem cell factor; tube differentiation; angiogenesis

間充質干細胞（mesenchymal stem cells， MSCs）是一類具有自我復制、更新和多向分化潛能的多功能細胞，主要來源于中胚層，可在骨髓、外周血、臍血、脂肪組織中分離提取[1]。當局部血管損傷時，MSCs能誘導分化為血管內皮細胞，同時分泌干細胞因子（stem cell factor， SCF）調節體內促血管新生細胞的增殖，使受損部位的血管以“發芽”的形式形成新的血管床，進而促進損傷血管的修復[2]。阿魏酸（ferulic acid， FA）屬酚酸類化合物，是中藥川芎、當歸的主要成分之一，具有抑制血小板聚集、血管保護及抗氧化等作用[3-4]，研究[5]發現其具有促進血管新生、保護內皮細胞的作用。本研究將探討FA對人臍帶血間充質干細胞（human umbilical cord blood mesenchy?

mal stem cells， hUCBMSCs）增殖、分泌SCF和成管分化的影響，為活血化瘀藥川芎、當歸在臨床上的應用提供新的理論基礎。

1 材料

1.1? 藥品與試劑

FA（批號：S31399，純度≥99.0%）、人淋巴細胞分離液（批號：P8610）均購自中國北京索萊寶科技有限公司;胎牛血清（批號：10270-106）、胰酶（批號：15050-057）均購自美國Gibco公司;青霉素-鏈霉素雙抗溶液（批號：KGY002，中國南京凱基生物科技發展有限公司）;PBS液（批號：SH30256.01B）、DMEM/F12培養基（批號：SH30023.01B）均購自美國Hyclone公司;hUCBMSCs成骨誘導分化培養基試劑盒（批號：HUXUB-90021）、hUCBMSCs成軟骨誘導分化培養基試劑盒（批號：HUXUB-90042）、hUCBMSCs成脂肪誘導分化培養基試劑盒（批號：HUXMA-90031）均購自美國OriCell公司;茜素紅染液（批號：130-22-3RT）、油紅O染液（批號：O1391-250ML）均購自美國Sigma公司;阿爾新藍染液（批號：MAS0981，中國MesGen公司）;細胞計數試劑盒（批號：C0037，中國碧云天生物技術研究公司）;SCF-ELISA試劑盒（批號：KS14694，中國上海江萊生物科技有限公司）。

1.2? 實驗儀器

CO2培養箱（型號：XD-101，日本SANYO公司）;熒光顯微鏡（型號：BX51，日本OLYMPUS公司）;酶聯免疫檢測儀（型號：MK3，美國Thermo公司）;96孔板（型號：3590，美國Corning公司）;超凈工作臺（型號：SW-CJ-1FD，中國蘇州凈化公司）;臺式低速離心機（型號：5415R）、4 ℃離心機[型號：5804（R）]均購自德國Eppendorf公司;振蕩器（型號：WH-2，中國上海滬西分析儀器廠）。

2 方法

2.1? hUCBMSCs分離與培養

無菌條件下取足月健康新生兒臍帶血10 mL，加入20 U/mL肝素室溫靜置。將人淋巴細胞分離液移入離心管中，加入細胞懸液（將臍帶血與PBS液1﹕1稀釋混勻）經密度梯度離心后得到單個核細胞，再移入含5%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的DMEM/F12培養基中，37 ℃培養箱中培養7 d，傳代到第3代凍存。

2.2? hUCBMSCs的誘導分化鑒定

將凍存細胞復蘇，當細胞融合到80%左右時，胰酶消化，接種到明膠包被的24孔板，每組設4個復孔，37 ℃、5% CO2培養箱中培養，當細胞融合到60%～70%時，分別按照hUCBMSCs成骨誘導分化培養基試劑盒、hUCBMSCs成軟骨誘導分化培養基試劑盒、hUCBMSCs成脂肪誘導分化培養基試劑盒說明書要求，將細胞移入相應培養基中培養[成骨誘導分化完全培養基：含10%胎牛血清、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、0.1 μmol/L地塞米松、50 μg/mL抗壞血酸的DMEM/F12培養基;成軟骨誘導分化完全培養基：含體積分數為10%胎牛血清、1 mmol/L丙酮酸鈉、10 μg/L轉化生長因子β、50 g/L ITS（10 μg/L胰島素、5.5 μg/L轉鐵蛋白、0.67 μg/L亞硒酸鈉）、0.1 μmol/L地塞米松、50 μg/mL抗壞血酸的DMEM/F12培養基;成脂誘導分化培養基：含10%胎牛血清、0.1 μmol/L地塞米松、10 mg/L胰島素、0.5 mmol/L異丁基黃嘌呤、200 μmol/L消炎痛的DMEM/F12培養基]，每3 d更換1次培養基，視細胞形態變化及生長情況，分別用茜素紅、阿爾新藍及油紅O染色以確定細胞成骨、成軟骨、成脂肪染色效果。在熒光顯微鏡下觀察染色效果并拍照。

2.3? FA促hUCBMSCs增殖的最佳濃度測定

將FA加入DMEM/F12培養基溶解至10 mL，反復吹打至充分溶解，0.22 μm濾過膜濾過，于

-20 ℃保存備用。依據CCK-8細胞計數試劑盒說明書要求，收集對數生長期的hUCBMSCs，離心收集后置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h使細胞貼壁。胰酶消化后在96孔板中配制100 μL細胞懸液，每孔1×104個細胞，放置在37 ℃、5% CO2的培養箱預培養24 h，隨后加入FA至各DMEM/F12培養基中，分別稀釋至FA終濃度為0、1、2、4、8、16 mg/L，培養48 h后加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度（OD值）。同時設置對照孔，每組設定3個復孔。

2.4? 實驗分組及干預方法

將hUCBMSCs隨機分為實驗組和對照組，每孔1×105個細胞，實驗組用最佳濃度FA干預，對照組用等體積的PBS液處理。

2.5? CCK-8測定hUCBMSCs增殖能力

按“2.4”項分組培養各組細胞48 h，收集各組細胞，依據CCK-8細胞計數試劑盒說明書要求，用酶標儀測定各組細胞在450 nm處的OD值。

2.6? ELISA檢測hUCBMSCs分泌SCF能力

按“2.4”項分組培養各組細胞48 h，收集各組上清液，參照ELISA試劑盒說明書，測定酶標儀在450 nm的OD值。

2.7? Matrigel體外成管試驗檢測hUCBMSCs成管能力

Matrigel基質膠4 ℃過夜溶解，槍頭盒、EP管、96孔板均4 ℃過夜預冷，次日在冰盒上進行鋪膠。當各組細胞融合至80%左右時，胰酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM重懸，調整細胞密度至1×105，培養至細胞貼壁時，各組分別加入最適濃度FA及等容量PBS液，37 ℃孵箱孵育24 h，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。每孔隨機選取4個視野計算小管形成長度，取平均值。

2.8? 免疫熒光法檢測hUCBMSCs內皮分化能力

在培養板中放置載玻片，玻片上滴加2 mL含有1×106/mL的hUCBMSCs細胞懸液，加入FA對hUCBM?SCs干預48 h后取出并固定30 min，用PBS沖洗。滴加3% H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗。用0.5%Triton X-100（PBS配制）室溫通透20 min后PBS沖洗并吸干，滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min;分別滴加1∶50稀釋的CD31抗體和1∶250稀釋的vWF抗體，濕盒4 ℃孵育過夜后，PBST 浸洗，滴加稀釋好的熒光二抗山羊抗小鼠IgG H&L（FITC），濕盒中20～37 ℃孵育1 h，PBST再浸洗;滴加DAPI避光孵育5 min，進行核復染，PBST浸洗;去除液體，加50%甘油，然后熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，并采用Image J軟件進行定量分析。

2.9? 統計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行統計。計量資料以“x±s”表示，檢驗各組數據的正態性和方差齊性，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1? hUCBMSCs的培養情況

光學顯微鏡下觀察第3代細胞，細胞邊緣清晰，形態均一，排列整齊，呈典型的長梭狀結構，排列呈漩渦狀。見圖1。

3.2? hUCBMSCs的鑒定結果

取第4代hUCBMSCs向成骨細胞定向誘導分化：經成骨誘導分化培養基誘導培養4周，茜紅素染液染色后，可見鈣結節呈紅色為陽性，見圖2A，表明hUCBMSCs被誘導分化為骨細胞。取第4代hUCBMSCs向成軟骨細胞定向誘導分化：經成軟骨誘導分化培養基誘導培養21 d，阿爾新藍染色后，細胞呈藍色，見圖2B，表明hUCBMSCs被誘導分化為軟骨細胞。取第4代hUCBMSCs向成脂肪細胞定向誘導分化：經成脂肪誘導分化培養基誘導培養14 d，油紅O染液染色后可見空泡狀脂滴呈橘紅色，見圖2C，表明hUCBMSCs被誘導分化為脂肪細胞。

3.3? FA促hUCBMSCs增殖的最佳濃度測定結果

隨著FA處理濃度的增加，hUCBMSCs增殖能力逐漸增強;當FA濃度為2 mg/L時，細胞增殖能力最強;隨后FA濃度繼續增加，hUCBMSCs的增殖能力逐漸減弱。因此，FA促hUCBMSCs增殖的最佳濃度為2 mg/L。見圖3。

3.4? FA對hUCBMSCs增殖能力的影響

對照組和實驗組的OD值分別為（0.354±0.020）和（0.506±0.022），實驗組細胞增殖能力明顯強于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖4。

3.5? FA對hUCBMSCs分泌SCF的影響

對照組和實驗組分泌SCF含量分別為（109.990±3.629） pg/mL和（367.747±36.948） pg/mL。與對照組比較，實驗組分泌SCF含量增加，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖5。

3.6? FA誘導hUCBMSCs體外成管情況

對照組和實驗組hUCBMSCs體外形成管網狀結構的長度分別為（95.533±6.315） mm和（299.657±28.239） mm，實驗組形成的血管長度明顯長于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖6-7。

3.7? FA誘導hUCBMSCs向內皮分化情況

與對照組相比，實驗組CD31和vWF蛋白免疫熒光強度顯著增高，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖8-10。

4 討論

MSCs是一類具有高度增殖、自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，廣泛存在于機體內，在特定誘導條件下可分化成神經元、心肌細胞、骨細胞、成骨細胞、內皮細胞等多種細胞，移植進入機體可替換損傷組織或產生修復因子促進組織再生[6-7]。因此，MSCs具有廣泛的應用前景，極大地推動了再生醫學的發展和退行性疾病的治療。目前，MSCs的獲得主要來源于骨髓、外周血、脂肪、臍血中[1]。研究[2，8-10]發現，MSCs旁分泌的SCF是C-Kit原癌基因編碼受體的配體蛋白，它參與機體發育中的多種細胞生長的調控，是一種多功能細胞生長因子，在MSCs增殖、分化和遷移過程中發揮重要的調控作用。Cao Z Y團隊[11]研究發現，SCF可能通過表達與PI3K/AKT、ERK1/2和STAT3信號通路相關的蛋白質用以維持線粒體功能，從而維持人骨髓MSCs活性。

四物湯是養血活血的基礎方劑，由熟地黃、當歸、川芎、白芍組成，當歸具有補血養肝、活血調經之效，川芎辛散溫通，能活血行氣止痛。FA作為兩藥的主要活性成分之一，其化學名是4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，現代藥理研究[4，12]發現，FA具有抗氧化、抗血栓、抗炎癥、抗血脂等作用。石定[13]發現FA能促進內皮細胞增殖、遷移并上調VEGF、PDGF及HIF-1α蛋白的表達，提高創面組織中微血管密度，促進大鼠慢性創面愈合。李玉梅等[14]證實，黃芪甲苷聯合FA對氯化鈷所致的缺氧人臍靜脈內皮細胞具有保護作用，能促進內皮細胞遷移，有利于血管生成，其機制可能與激活JAK-STAT信號通路有關。以上研究均證實FA具有促進血管新生、保護內皮細胞的潛能。婁遠蕾等[15]發現，MSCs經阿魏酸鈉誘導后向神經細胞分化，誘導分化的細胞能在腦缺血大鼠腦內存活，且主要分布在缺血側損傷區，并仍保留已分化神經細胞的特性。Qu Q X等[5]研究發現，miRNA-126-3p修飾的hUCBMSCs移植對靜脈移植物具有更高的重新內皮化。本研究是基于FA具有血管新生的作用和MSCs在特定條件下能定向分化為內皮細胞的文獻報道，而將兩者聯系在一起展開的研究。

本研究探討了FA對hUCBMSCs增殖、分泌SCF和定向內皮分化的影響。結果發現，2 mg/L FA為促進hUCBMSCs增殖的最佳濃度，且對hUCBMSCs具有保護作用。隨著FA濃度的不斷增加，hUCBMSCs增殖能力較正常狀態下降，考慮高濃度的FA可能對hUCBMSCs具有毒性。對照組和實驗組分泌SCF含量分別為（109.990±3.629） pg/mL和（367.747±36.948） pg/mL，結果表明，與對照組相比，2 mg/L FA能顯著促進MSCs增殖及分泌SCF（P<0.05），誘導MSCs向內皮細胞定向分化，促使其體外成管（P<0.05）。其機制可能是FA促進MSCs增殖及分泌大量SCF，SCF作為一種多功能細胞生長因子又能自分泌調控MSCs，促進MSCs向內皮細胞分化，進而促進新的血管床形成，這與石定[13]的研究結果相符合。然其具體作用機制尚不明確，需要進一步實驗探究。同時，本實驗為離體細胞實驗，尚存在一定缺陷，FA介導hUCBMSCs發揮血管新生的具體作用機制及FA在血管新生方面的臨床應用價值，有待后續實驗研究中進一步挖掘。

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